Colorazione di Giemsa in Citologia: Guida Completa al Protocollo e Applicazioni Essenziali

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono tecniche di colorazione tipo Romanovsky, cioè metacromatiche differenziali. La base è sempre costituita dal blu di metilene e eosina e una soluzione alcolica; a queste si può aggiungere uno dei tre coloranti May Grünwald-Wright-Giemsa, oppure questi possono essere usati come coloranti unici. In questo caso prevedono i coloranti di base in un’unica soluzione alcolica.

La soluzione di Giemsa, ad esempio, è una miscela complessa, costituita da blu di metilene cloruro, blu dimetilene eosinato, azzurro II eosinato. I nuclei assumeranno svariate tonalità di viola. Il colore del citoplasma sarà di varie gradazioni, dal blu al rosa pallido. Nel citoplasma di alcuni tipi di cellule potrebbero comparire alcuni granuli dal rossiccio al lilla. I basofili saranno caratterizzati dalla presenza di granuli tra il blu scuro e il nero nel citoplasma. Gli eosinofili saranno caratterizzati dalla presenza di granuli di color arancione vivo nel citoplasma.

Questi coloranti, in modo analogo al Diff Quick, sono utili all’identificazione dei trofozoiti del Phylum Apicomplexa, oltre a parassiti fecali ed emoparassiti. Le cellule appariranno di colore azzurro o azzurro-grigi per il citoplasma e rosso-porpora viola per il nucleo.

Protocollo di Colorazione di Giemsa

La colorazione di Giemsa richiede una gestione accurata a causa della tossicità dei reagenti e della precisione del metodo. Ecco un protocollo di base:

Fissare i vetrini in metanolo per 5-7 minuti.
Dopo avere asciugato all’aria lo striscio di sangue, immergerlo nella soluzione di Giemsa non diluita per 5-6 minuti.
Diluire la colorazione di Giemsa con tampone a pH 7,2 rapporto 1:20.
Asciugare all’aria.

Considerazioni Importanti

Nella valutazione dei risultati va ricordato che:

Il quadro cromatico è fortemente influenzato dal pH delle acque di lavaggio e del tampone di diluizione.
L’intensità della colorazione può variare in funzione dei tempi di differenziazione.

Tecniche di Colorazione Alternative e Complementari

Le colorazioni istochimiche speciali e l’esame immunoistochimico sono delle tecniche diagnostiche ancillari all’esame istopatologico, che possono essere richieste o suggerite per confermare la diagnosi o fornire informazioni aggiuntive rispetto a quanto osservabile con la sola valutazione istopatologica (con colorazione di routine Ematossilina ed Eosina). Nella maggior parte dei casi si tratta di esami eseguibili sul campione già inviato in formalina e solo una piccola percentuale di colorazioni va eseguita su campione di tessuto non fissato in formalina e congelato.

Colorazione Istochimica

La colorazione istochimica semplicemente permetterà di “vedere meglio” l’agente eziologico se presente. Talvolta la morfologia dell’agente sarà sufficiente a classificarlo precisamente, ma talvolta si potrà solo confermare la presenza di un agente e classificarlo come batterico, fungino, ecc.

Esame Immunoistochimico

L’esame immunoistochimico, come indica il nome stesso, prevede l’utilizzo di anticorpi attraverso i quali sarà possibile individuare specifiche molecole nella sezione di tessuto. L’esame immunoistochimico può essere eseguito per via diretta o indiretta, anche se attualmente la maggior parte dei kit e coloratori automatici utilizzano una metodologia indiretta. La metodica indiretta si avvale di un anticorpo definito “primario” che legherà un determinato antigene che si vuole identificare nella sezione di tessuto.

Nella diagnostica di routine l’esame immunoistochimico viene principalmente utilizzato per una migliore caratterizzazione delle neoplasie la cui istogenesi non può essere totalmente definita con la sola valutazione istopatologica. Per tale scopo vengono utilizzati anticorpi che legano componenti cellulari intracitoplasmatici (es. citocheratine, vimentina), della membrana cellulare (es. CD3, CD20) o nucleari (es. MUM1) che sono specifiche e presenti in una o più popolazioni cellulari.

Al contrario, in neoplasie anaplastiche o scarsamente differenziate, l’esame immunoistochimico può essere non definitivo, in quanto il processo di “sdifferenziazione” può implicare la “perdita” dell’espressione delle molecole fenotipiche specifiche che le caratterizzano, e pertanto risultare non definitivamente classificabili.

L’identificazione di determinate molecole a scopo clinico-prognostico-terapeutico (es.

Per la ricerca di agenti eziologici è necessario sottolineare alcune differenze rispetto alle colorazioni istochimiche speciali discusse precedentemente. Come già detto, nell’esame immunoistochimico si testano anticorpi specifici e se l’esito è positivo si potrà confermare la presenza di un agente specifico che si è ricercato. L’esame immunoistochimica per malattie infettive in medicina veterinaria trova un particolare utilizzo per malattie virali (es.

È importante segnalare come alcuni fattori possano incidere sull’ottimale riuscita dell’esame immunoistochimico e quindi rendere l’esame non praticabile o definitivo: alcuni trattamenti (es. corticosteroidi nel linfoma) possono alterare le caratteristiche fenotipiche delle cellule che possono risultare negative. Un’inadeguata (scarsa o eccessiva) fissazione del campione, con presenza di autolisi e necrosi, possono inficiare l’ottimale riuscita dell’esame.

Va infine sottolineato che solo alcune colorazioni immuno-istochimiche possono essere anche applicate ai campioni citologici (es. Immuno-citochimica per CD3 e CD20, per la tipizzazione di un linfoma), ma è importante rivolgersi al laboratorio per avere informazioni sulla fattibilità dell’esame. Esistono casi di linfoma negativi per entrambi gli anticorpi. Talvolta l’esame immunoistochimico non è sufficiente a definire la diagnosi di linfoma e potrebbe essere suggerito l’esame di clonalità linfoide.

Applicazioni Specifiche

Mastocitoma

Le colorazioni istochimiche Blu di Toluidina e GIEMSA spesso evidenziano i granuli dei mastociti (normali e neoplastici), che vengono definiti metacromatici. Queste colorazioni possono essere suggerite per confermare il sospetto di mastocitoma e migliorare la sensibilità nel ricercare e quantificare mastociti in un linfonodo. Quest’ultima evenienza permette di classificare l’eventuale coinvolgimento linfonodale secondo la classificazione di Weishaar (J. Comp.Path. 2014, Vol.

Neoplasie Melanocitiche

Sono molteplici invece i marker immunoistochimici che nel tempo si sono utilizzati per indicare l’origine melanocitica di neoplasie non pigmentate. Attualmente i più utilizzati sono PNL2 e Melan A. Nel nostro laboratorio, il Melan A è incluso nell’anticorpo “Melanoma Triple Cocktail” che include anche altri due anticorpi meno noti. CSPG4 viene proposto perché la sua valutazione è utile in caso di terapia elettrovaccinale sperimentale (Piras et al. Vet Comp Oncol.

Neoplasie Epiteliali

Le molecole che si utilizzano per l’identificazione immunoistochimica dell’istogenesi epiteliale sono le citocheratine. Esistono numerose citocheratine (filamenti intracellulari), alcune presenti in molte cellule di origine epiteliale (citocheratine AE1/AE3 o pancitocheratina), mentre altre sono specifiche per una o poche linee epiteliali (es.