Colorazione May-Grünwald Giemsa: Guida Completa ai Principi e alla Procedura Passo Passo

Gli esami di laboratorio non dovrebbero esistere isolati dal contesto clinico.

Per valutare e interpretare un esame diagnostico è necessario conoscere come si comporta nel “malato” e nel “sano”.

L’esame ideale dovrebbe essere anomalo nel 100% dei malati e non essere anomalo nel 100% dei soggetti sani.

Questo ideale è raggiunto molto di rado; generalmente si verifica una sovrapposizione tra i due gruppi di soggetti.

È pertanto utile ricordare alcune definizione di carattere epidemiologico che sono utili nel definire le capacità diagnostiche di un test.

Sensibilità e Specificità

Sensibilità (percentuale dei risultati veri positivi) è la percentuale di risultati positivi di un esame nei pazienti affetti da una malattia.

Un esame che è sempre anomalo (o positivo) nei pazienti malati ha una sensibilità del 100%.

Specificità (percentuale dei risultati veri negativi) è la percentuale dei risultati negativi di un esame nei pazienti non affetti da malattia.

Valore Predittivo

Prima di considerare l’effetto della prevalenza della malattia sui processi decisionali diagnostici, è necessario considerare il valore predittivo di un risultato positivo e di un risultato negativo.

In pratica si esprime in tal modo la probabilità che un risultato anomalo sia interpretato dal clinico come proprio di un soggetto malato.

Valore predittivo positivo di un test (VPP) esprime la probabilità che un soggetto con risultato positivo al test sia realmente affetto da malattia.

Esso dipende dalla specificità e dalla prevalenza della malattia nella popolazione a cui viene applicato un test: tanto più alte sono la prevalenza e la specificità e tanto maggiore sarà il valore predittivo positivo di un test.

Valore predittivo negativo di un test (VPN) esprime la probabilità che un soggetto con risultato negativo al test sia realmente sano.

Esso dipende dalla sensibilità e dalla prevalenza della malattia nella popolazione a cui viene applicato un test: tanto più alta è la sensibilità e tanto minore è la prevalenza e tanto maggiore sarà il valore predittivo negativo di un test.

Statisticamente la probabilità di essere affetto da malattia o di non esserlo, a seconda che il test sia risultato positivo o negativo, è espressa dal teorema di Bayes.

Intervalli di Riferimento

I risultati degli esami di laboratorio sono accompagnati dai cosiddetti "intervalli di riferimento" (IR), che sono limiti con cui il clinico confronta il valore misurato nel singolo soggetto.

L’intervallo di riferimento è ottenuto misurando un particolare analita in un campione di individui estratto da una popolazione di riferimento.

Gli individui di riferimento non sono necessariamente sani, ma semplicemente individui selezionati utilizzando criteri ben definiti.

La valutazione della variabile nel campione di riferimento fornisce valori numerici denominati limiti di riferimento.

Dal punto di vista pratico si devono selezionare in modo casuale gli individui dalla popolazione generale utilizzando dei criteri predefiniti che possono tenere conto, a seconda dei casi, di sesso, età, assunzione o meno di farmaci ed, eventualmente, dei risultati di accertamenti diagnostici di tipo generale.

Quando i risultati ottenuti nel gruppo di riferimento sono analizzati, essi si distribuiscono intorno a un valore centrale con una distribuzione che può essere simmetrica (spesso gaussiana) o più frequentemente asimmetrica (con coda a destra).

Il metodo più utilizzato per scegliere l’intervallo di riferimento da questi risultati è quello di calcolare il 95% centrale della distribuzione.

L’intervallo comprende cioè la popolazione compresa tra il percentile 2.5 e il 97.5.

Per le variabili in cui si ha un eccesso di asimmetria con una coda importante a destra, la definizione dell’intervallo di riferimento prevede la trasformazione logaritmica dei risultati, al fine di rendere più simmetrica (gaussiana) la distribuzione dei valori.

Le caratteristiche analitiche di accuratezza e di precisione influenzano l’intervallo di riferimento: se viene usato un metodo non accurato, l’intervallo di riferimento rifletterà lo scostamento del metodo, mentre se un metodo non è preciso, l’intervallo di riferimento risulterà allargato (aumenterà la DS della distribuzione dei risultati).

L’intervallo andrebbe accompagnato sempre da un indice della variabilità campionaria della stima, il cosiddetto intervallo di confidenza, espresso di solito al 90% (vengono indicati i due valori entro cui vi è una probabilità del 90% che vi sia il limite di riferimento superiore ed inferiore).

Gli IR sono spesso utilizzati sia dal clinico che dal paziente come limiti in grado di discriminare il soggetto sano da quello malato.

Si sta affermando, tuttavia, il concetto che, nonostante possano aiutare a individuare lo stato di benessere, siano spesso poco efficienti, o addirittura fuorvianti, per diagnosticare una condizione di malattia.

È importante distinguere valori di riferimento cumulativi, valori di riferimento individuali e limiti decisionali (1,2).

Valori di riferimento cumulativi

Il lavoro che il Committee on Reference Values della International Federation of Clinical Chemistry ha compiuto tra il 1978 ed il 1988 ha portato alla sistematizzazione della "Teoria degli Intervalli di riferimento", che ha codificato in modo preciso come calcolare gli IR (compresi in genere tra i percentili 2.5 e 97.5).

Si tratta di un lavoro fondamentale dal punto di vista teorico, ma che presenta difficoltà di applicazione pressoché insormontabili nel mondo reale.

Il clinico (l'endocrinologo in particolare) si trova quotidianamente di fronte alla dicotomia tra quanto è descritto in letteratura e quanto è riportato sui referti e si trova in difficoltà nell'interpretare risultati provenienti da laboratori distanti pochi chilometri che impiegano diverse nomenclature, IR e unità di misura.

È fondamentale osservare come molti degli esami di laboratorio abbiano perduto la loro natura di essere diagnostici per acquisire quella di escludere, quando negativi, lo stato di malattia.

Valori di riferimento individuali

Spesso l'IR calcolato nella popolazione generale è molto più ampio di quello proprio del singolo individuo, per esempio, per gli ormoni tiroidei e per il TSH (3).

Variazioni nel tempo di tali ormoni possono essere clinicamente rilevanti, pur non superando i limiti di riferimento.

Purtroppo, i valori di riferimento individuali non sono utilizzabili nella pratica clinica.

Limiti decisionali (o soglie decisionali, cut-off)

Si tratta di un concetto proposto nel 1968, che indica valori soglia, sopra o sotto ai quali il clinico prende una determinata decisione o tiene un determinato comportamento clinico.

Si tratta di limiti empirici, che dipendono fortemente dal tipo di ormone e dal contesto in cui opera l'endocrinologo e sono più vicini alla diagnosi rispetto all'IR.

Hanno finalità pratiche: a seconda che la concentrazione dell’analita misurata nel paziente sia sopra o sotto questi livelli, il clinico prende decisioni cliniche importanti (iniziare o sospendere una terapia, fare altre indagini diagnostiche, disporre il ricovero, programmare un intervento, dimettere il paziente).

Richiedono una stretta collaborazione tra clinico e laboratorio: se il laboratorio cambia il metodo analitico senza comunicarlo tempestivamente al clinico, vi possono essere gravi conseguenze.

In Endocrinologia è particolarmente importante che nel referto sia indicato il metodo impiegato per determinare un ormone e che sia evitato l'uso di intervalli ricavati dalla letteratura.

Influenza della variabilità biologica

Sempre maggiore importanza viene data alle cause biologiche di variazione dei risultati.

Infatti, la concentrazione di ogni analita, indipendentemente dalla variabilità analitica, non rimane assolutamente costante nel tempo, nello stato di salute e di malattia, ma oscilla intorno ad un punto omeostatico che è specifico del soggetto o generale.

Tra le cause di variabilità intra-individuale possono essere ricordate: l’età, che può influenzare la concentrazione di un costituente del sangue nei primi giorni di vita, durante l’adolescenza e nell’età avanzata; la dieta, che influenza molti esami (tra i più classici la curva da carico di glucosio, l’escrezione urinaria di idrossiprolina e di calcio).

Vi sono alimenti comuni che hanno effetti particolari e rilevanti.

La caffeina, per esempio, aumenta la concentrazione di glucosio e altera la tolleranza al carico di glucosio, riduce il ritmo circadiano del cortisolo, aumenta la concentrazione di sodio, potassio, calcio e magnesio nelle urine; le caratteristiche secretorie specifiche dei diversi ormoni, quali il ritmo circadiano che determina concentrazioni diverse nel corso della giornata particolarmente rilevanti per ACTH e cortisolo, e i picchi secretori per il GH; la postura: passare dalla posizione supina a quella eretta porta ad una riduzione del volume di sangue del 10%, con conseguente aumento della concentrazione di proteine, enzimi ed ormoni proteici, poiché solo il fluido privo di proteine passa nei tessuti; il fumo, attraverso l’azione della nicotina, può influenzare molti esami di laboratorio in modo proporzionato al numero di sigarette fumate.

La concentrazione di glucosio plasmatico può aumentare di 10 mg/dL (0.56 mmol/L) entro 10 minuti dal momento in cui si è fumato; tale effetto può protrarsi per un’ora.

I fumatori tendono avere una concentrazione di glucosio più alta rispetto ai non fumatori, con un’alterata tolleranza glicemica.

Imprecisione analitica

I risultati analitici sono tuttavia soggetti a errore, indipendentemente dalla qualità del laboratorio e dall’abilità di chi vi lavora.

Gli aspetti quantitativi della mancanza di precisione meritano di essere chiariti.

Ad esempio, se misuriamo molte volte la concentrazione di ACTH in un campione di plasma con due metodi diversi, uno molto preciso ed uno poco preciso, l’istogramma della distribuzione dei risultati avrà in entrambi i casi un aspetto (normale) gaussiano, ma nel caso del metodo preciso i risultati saranno più concentrati intorno alla concentrazione media.

La deviazione standard (DS) è la misura di questa distribuzione intorno al valore medio: la DS è grande se la distribuzione è ampia ed è piccola se la distribuzione è stretta.

Per i dati che hanno distribuzione gaussiana, come avviene nel caso degli errori analitici, l’aspetto della curva è completamente definito dalla media e dalla DS.

È importante che il medico di laboratorio comunichi ai clinici i dati relativi all’imprecisione analitica dei diversi esami che sono a loro disposizione.