Colorazione di Giemsa in Istologia: Protocollo Completo e Applicazioni Essenziali da Conoscere

Le colorazioni istochimiche speciali e l’esame immunoistochimico sono delle tecniche diagnostiche ancillari all’esame istopatologico, che possono essere richieste/suggerite per confermare la diagnosi o fornire informazioni aggiuntive rispetto a quanto osservabile con la sola valutazione istopatologica (con colorazione di routine Ematossilina ed Eosina).

Esami Immunoistochimici e Colorazioni Speciali

Nella maggior parte dei casi si tratta di esami eseguibili sul campione già inviato in formalina e solo una piccola percentuale di colorazioni va eseguita su campione di tessuto non fissato in formalina e congelato. La colorazione istochimica semplicemente permetterà di “vedere meglio” l’agente eziologico se presente. Talvolta la morfologia dell’agente sarà sufficiente a classificarlo precisamente ma talvolta si potrà solo confermare la presenza di un agente e classificarlo come batterico, fungino, ecc.

L’esame immunoistochimico, come indica il nome stesso, prevede l’utilizzo di anticorpi attraverso i quali sarà possibile individuare specifiche molecole nella sezione di tessuto. L’esame immunoistochimico può essere eseguito per via diretta o indiretta, anche se attualmente la maggior parte dei kit e coloratori automatici, utilizzano una metodologia indiretta. La metodica indiretta si avvale di un anticorpo definito “primario” che legherà un determinato antigene che si vuole identificare nella sezione di tessuto.

Nella diagnostica di routine l’esame immunoistochimico viene principalmente utilizzato per una migliore caratterizzazione delle neoplasie la cui istogenesi non può essere totalmente definita con la sola valutazione istopatologica. Per tale scopo vengono utilizzati anticorpi che legano componenti cellulari intracitoplasmatici (es. citocheratine, vimentina), della membrana cellulare (es. CD3, CD20) o nucleari (es. MUM1) che sono specifiche e presenti in una o più popolazioni cellulari.

Al contrario, in neoplasie anaplastiche o scarsamente differenziate, l’esame immunoistochimico può essere non definitivo, in quanto il processo di “sdifferenziazione” può implicare la “perdita” dell’espressione delle molecole fenotipiche specifiche che le caratterizzano, e pertanto risultare non definitivamente classificabili.

Per la ricerca di agenti eziologici è necessario sottolineare alcune differenze rispetto alle colorazioni istochimiche speciali discusse precedentemente. Come già detto, nell’esame immunoistochimico si testano anticorpi specifici e se l’esito è positivo si potrà confermare la presenza di un agente specifico che si è ricercato. L’esame immunoistochimica per malattie infettive in medicina veterinaria trova un particolare utilizzo per malattie virali (es.

È importante segnalare come alcuni fattori possano incidere sull’ottimale riuscita dell’esame immunoistochimico e quindi rendere l’esame non praticabile o definitivo: alcuni trattamenti (es. corticosteroidi nel linfoma), possono alterare le caratteristiche fenotipiche delle cellule che possono risultare negative. Un’inadeguata (scarsa o eccessiva) fissazione del campione, con presenza di autolisi e necrosi, possono inficiare l’ottimale riuscita dell’esame.

Va infine sottolineato che alcune solo alcune colorazioni immuno-istochimiche possono essere anche applicate ai campioni citologici (es. Immuno-citochimica per CD3 e CD20, per la tipizzazione di un linfoma), ma è importante rivolgersi al laboratorio per avere informazioni sulla fattibilità dell’esame. Nota bene: esistono casi di linfoma negativi per entrambi gli anticorpi. Talvolta l’esame immunoistochimico non è sufficiente a definire la diagnosi di linfoma e potrebbe essere suggerito l’esame di clonalità linfoide.

Applicazioni Specifiche della Colorazione di Giemsa

Mastocitoma

Le colorazioni istochimiche Blu di Toluidina e GIEMSA spesso evidenziano i granuli dei mastociti (normali e neoplastici), che vengono definiti metacromatici. Queste colorazioni possono essere suggerite per confermare il sospetto di mastocitoma e migliorare la sensibilità nel ricercare e quantificare mastociti in un linfonodo. Quest’ultima evenienza permette di classificare l’eventuale coinvolgimento linfonodale secondo la classificazione di Weishaar.

Neoplasie Epiteliali

Le molecole che si utilizzano per l’identificazione immunoistochimica dell’istogenesi epiteliale sono le citocheratine. Esistono numerose citocheratine (filamenti intracellulari), alcune presenti in molte cellule di origine epiteliale (citocheratine AE1/AE3 o pancitocheratina), mentre altre sono specifiche per una o poche linee epiteliali.

Colorazione di Wright-Giemsa: Obiettivo e Applicazioni

La colorazione di Wright-Giemsa viene utilizzata quando bisogna analizzare campioni freschi di fluidi corporei umani o animali quali sangue intero, feci o liquido cerebrospinale, con lo scopo di ricercare alcune specie parassite eventualmente presenti che siano indifferentemente di tipo procariote oppure eucariote. Questa tecnica è infatti molto versatile e viene utilizzata nella pratica clinica come strumento diagnostico per individuare i più comuni parassiti del sangue, oltre che per le clamidie, per le rickettsie e per il genere Borrelia di cui fa parte l’agente eziologico della malattia di Lyme.

Inoltre permette d’identificare la presenza delle principali specie di Pneumocystis (un fungo patogeno per l’uomo), dà ottimi risultati nella ricerca diagnostica della Dientamoeba fragilis (un’ameba parassita dell’intestino umano), nonché per i più comuni protozoi flagellati parassiti del tratto intestinale. Data la sua versatilità, è inoltre usata per la diagnosi di malaria perchè permette di evidenziare senza ambiguità la presenza di Plasmodium falciparum. Ultima applicazione ma non certo in ordine d’importanza, si ha per la ricerca di parassiti del genere dei Toxoplasma, protisti di cui fa parte l’agente eziologico della temuta toxoplasmosi. La colorazione di Wright-Giemsa non è invece applicabile in presenza di altri tipi di parassiti, siano essi protozoici, fungini o batterici.

Principi della Colorazione di Wright-Giemsa

La colorazione di Wright-Giemsa nasce dalla combinazione di due diverse tecniche che provengono dall’ambito dell’Istologia umana e della Citogenetica: la colorazione di Wright (utilizzata per la differenziazione ed il conteggio delle cellule del sangue) e la colorazione di Giemsa. Entrambi gli scienziati di cui porta il nome, Gustav Giemsa (1867-1948) e James Homer Wright (1869-1928), misero a punto le rispettive tecniche basandosi sullo stesso lavoro precedente, quello del medico russo Dmitri L. riferimento ciò che si osserva in questo caso.

Interpretazione dei Risultati

In generale, l’eosina colorerà il citoplasma delle cellule del plasma (monociti, leucociti, etc.) di una tonalità piuttosto uniforme tra il viola ed il cobalto, mentre il blu di metilene ne colorerà i nuclei virando in tonalità accese sul porpora. I risultati ottenuti dipendono strettamente dal tipo di specie parassita contenuta nel campione: in alcuni casi, essi potrebbero risultare chiaramente distinguibili perchè avranno colori invertiti per nuclei e citoplasma rispetto alle cellule ematiche, a causa della diversificata composizione chimica degli stessi costituenti cellulari. Alcuni parassiti tipici presentano invece una colorazione loro specifica, quando trattati col metodo Wright Giemsa: in tali casi, il confronto con i risultati tabulati in letteratura medica e l’esperienza del microscopista permetterà d’identificarli con precisione.

Esistono tuttavia casi in cui, come si suol dire, serve occhio, perchè le cellule del microrganismo e quelle endogene del campione possono non risultare così differenziate quanto a reazione ai coloranti o morfologia: per tale motivo questa tecnica deve sempre essere abbinata ad esami clinici ad hoc e non è da considerarsi risolutiva in senso stretto nel formulare una diagnosi.

Materiale Occorrente

Una boccetta, munita di contagocce, contenente acqua distillata;
Un vetrino per microscopio;
Preparato per “Wright Giemsa stain” in soluzione alcoolica (alcool metilico): in commercio se ne trovano di vari tipi, tutti ugualmente validi;
Olio per immersione specifico per microscopia;
Un vetrino coprioggetti.

Procedimento

Strisciare il campione da analizzare sul vetrino per microscopio e lasciar asciugare all’aria: in questa colorazione non si utilizza mai la fissazione al calore;
Con l’ausilio di un contagocce, porre sullo striscio una quantità di preparato per Wright Giemsa stain sufficiente a ricoprirlo completamente: in questa fase occorre contare attentamente quante gocce di colorante vengono utilizzate, perchè ciò servirà nel passaggio successivo. Lasciar agire per 3 minuti;
Senza togliere il colorante, aggiungere acqua distillata nella stessa quantità di quest’ultimo e lasciar agire per il doppio del tempo precedente (6 minuti);
Effettuare il lavaggio del vetrino con acqua distillata, quindi far asciugare per bene all’aria;
Quando il preparato non apparirà più bagnato, depositare alcune gocce di olio per immersione e attendere 10 minuti;
Coprire col vetrino porta oggetti.

Il campione è ora pronto per essere osservato al microscopio ottico.

Osservazione al Microscopio

Per sfruttare al meglio la risoluzione garantita da questa tecnica, si consiglia d’effettuare l’osservazione direttamente dall’obiettivo a 100x. Quello su cui invece si porrà l’accento è che tutto quello che potrebbe risultare fuori luogo in questo contesto, qualunque forma cellulare anomala nel colore tipico o nell’aspetto, deve subito indurre il microscopista ad approfondire la sua indagine.

Esempi di Identificazione di Parassiti

La ricerca in striscio di sangue dei parassiti del genere Trypanosoma è senza dubbio la più semplice: la caratteristica morfologia di questo protozoo si distanzia infatti nettamente da quella di tutte le altre cellule della componente plasmatica. Anche l’identificazione di Plasmodium falciparum si presenta del resto relativamente senza difficoltà.

Poiché nell’articolo si è citato anche l’utilizzo di matrici fecali come uno dei maggiori campi d’applicazione di questa colorazione di Wright-Giemsa, è bene spendere qualche parola anche per campioni di questo tipo. In genere le feci trattate con la colorazione di Wright-Giemsa presentano colori molto accesi e poche o trascurabili componenti cellulari; la presenza di parassiti in questo caso avviene sempre con gli stessi criteri già visti per gli strisci di sangue, fatto salvo caso particolari.

Diversamente da quanto accade infatti con le cellule endogene, il citoplasma risulta colorato di tonalità scure tra il blu ed il cobalto, mentre i nuclei sono porpora violetti. Ciò non toglie che alcuni risultati richiedano di consultare la letteratura medica per togliersi ogni dubbio: distinguere tra le forme cellulari possibili a volte può non essere affatto intuitivo.