Nella medicina di laboratorio, la sigla ANA - acronimo di Anti-nuclear antibody - identifica una vasta ed eterogenea popolazione di anticorpi anomali, diretti contro componenti delle cellule umane, in particolare nucleari (DNA, RNA, ribonucleoproteine, istoni, centromero ecc.). Gli anticorpi antinucleo rivestono una notevole importanza in campo medico, poiché - pur essendo presenti in minima quota in molti individui sani - tendono ad aumentare sensibilmente nel sangue dei soggetti affetti da malattie autoimmuni sistemiche (MAIS).
Il termine antinucleo è legato al fatto che i primi anticorpi scoperti erano diretti contro antigeni nucleari. Come anticipato, esistono differenti tipi di anticorpi anti-nucleo, classificati in base agli auto-antigeni verso i quali sono diretti.
Cosa sono gli anticorpi anti-nucleo (ANA)?
Gli anticorpi anti-nucleo (ANA) sono un gruppo di anticorpi prodotti dal sistema immunitario, il quale, a causa di un'alterata attività, non riesce più a riconoscere il “self” (parti dell'organismo di appartenenza) dal “non self” (sostanze estranee al corpo). Questi autoanticorpi attaccano erroneamente le cellule sane dell'organismo, causando segni e sintomi come: infiammazione di organi e tessuti, affaticamento e dolore articolare e muscolare. Nello specifico, gli ANA riconoscono alcune sostanze che si trovano nel nucleo della cellula, da cui il nome “anti-nucleo”.
La presenza degli ANA può essere considerata un marcatore di un processo autoimmune e permette di escludere altre condizioni con segni e sintomi simili. Il test degli anticorpi anti-nucleo (ANA) identifica la presenza di questi autoanticorpi nel sangue.
Quando e perché vengono prescritti questi anticorpi?
Ci sono poi vari segni e sintomi che possono essere associati a patologie autoimmuni, in presenza dei quali il clinico può richiedere il dosaggio di autoanticorpi come gli antinucleo. Bisogna tener presente che, da sola, la positività agli anticorpi antinucleo non è sufficiente a effettuare una diagnosi. Solitamente, invece, un test ANA con esito negativo indica una scarsa probabilità di una patologia autoimmune.
Nel caso in cui i risultati del test per gli ANA dovesse risultare positivi, potrebbero essere prescritti anche gli esami relativi al pannello Ena, ossia le analisi per la ricerca degli antigeni nucleari estraibili.
Come si esegue l'esame ANA?
Per l'analisi degli Anticorpi Anti Nucleo, il paziente si deve sottoporre a un prelievo di sangue da una vena del braccio. Non c’è una preparazione specifica indicata per poter effettuare il dosaggio degli anticorpi antinucleo. Prima di sottoporsi all'esame, il paziente deve osservare un digiuno di almeno 8-10 ore, durante le quali è ammessa l'assunzione di una modica quantità di acqua.
Metodiche di laboratorio
Esistono diverse metodiche per l'analisi degli ANA:
- Metodo IFA (dosaggio a immunofluorescenza indiretta): è considerato il metodo “gold standard” (di riferimento) per stabilire una diagnosi. Il campione di sangue del paziente è mescolato con le cellule che sono fissate al vetrino. Gli autoanticorpi che potrebbero essere presenti nel sangue reagiscono con le cellule. Il vetrino è trattato con un reagente contenente anticorpi fluorescenti ed esaminato al microscopio. Ciò che si osserva è la presenza (o l'assenza) della fluorescenza.
- Test immunometrico (enzyme linked immunosorbent assay-ELISA o test immunoenzimatico-EIA): viene eseguito con strumenti automatizzati, ma risulta meno sensibile del dosaggio a immunofluorescenza indiretta nella determinazione degli ANA. Pertanto, questa metodica può essere utilizzata per lo screening degli ANA; un risultato positivo o equivoco viene sottoposto, poi, all'IFA.
Immunofluorescenza indiretta (IFI)
Metodo dell’immunofluorescenza indiretta (Ifi), nel quale il risultato è espresso come rapporto tra il campione di sangue e una soluzione salina (titolo). In pratica indica quale sia la diluizione massima nella quale gli autoanticorpi sono ancora visibili. Ad esempio, un rapporto di 1 a 320 indica che in una diluizione di una parte del campione ematico con 320 parti di soluzione salina, gli autoanticorpi sono ancora visibili.
Il campione viene progressivamente diluito con una specifica soluzione (in genere salina), ovvero si aggiunge ad esempio una quantità di reagente di 40 parti ad una parte di campione, dopodiché si valuta se il colorante sia ancora visibile. Si procede con diluizioni successive fin quando è possibile osservare una colorazione. Il titolo ANA è quindi una misura della quantità di anticorpi nel sangue, più alto è il titolo, più autoanticorpi sono presenti nel campione, ad esempio un esito 1:160 significa che sono presenti anticorpi in grado di essere evidenziati fino ad una diluizione di 160 volte.
La metodica di riferimento per la loro evidenziazione è l’immunofluorescenza indiretta che utilizza come substrato cellule HEp2 (Human epitelioma type 2 cells). Importanti sono la definizione del Titolo e del Pattern fluoroscopio.
- L'utilizzo di linee cellulari consente l'espressione di antigeni presenti in tutte le fasi del ciclo cellulare e conseguentemente l'indicazione di specificità autoanticorpali non individuabili in sezioni di tessuto (anti-centromero, anti-fuso mitotico, anti-apparato mitotico, anti-apparato di Golgi, anti-centriolo etc.).
- La fissazione dei substrati in acetone.
- L'utilizzo di antisieri anti-Ig umani coniugati con FITC (ratio Fluorocromo/Proteina = 3; ratio Attività anticorpale specifica/Concentrazione proteica > 0.1). Sono usati sia antisieri anti-Ig umane polivalenti (reattivi con IgG, IgM ed IgA) sia antisieri specifici per IgG. In corso di LES, il 96% dei sieri presenta ANA di isotipo IgG (14). L'utilizzo di antisieri specifici per IgG evita l'individuazione di ANA di classe IgM frequentemente associati con l'Artrite Reumatoide, provocati dall'assunzione di farmaci e quelli riscontrabili in soggetti con età avanzata e di scarsa utilità clinica.
Modalità di refertazione: il risultato della ricerca di ANA va espresso come positività o negatività alla diluizione di screening utilizzata. Alcuni gruppi di lavoro suggeriscono che anche l'intensità dello staining debba essere segnalata nella risposta. Diluizioni di partenza < a 1/40 presentano una maggiore sensibilità ma una più bassa specificità, diluizioni > 1/160 una minore sensibilità ma una maggiore specificità (15). IL risultato può essere espresso come titolo, riportando l'ultima diluizione in cui il campione permane positivo (end point dilution). Tuttavia è raccomandazione generalmente accettata che la determinazione degli ANA abbia principalmente valore diagnostico ma che non sia altrettanto utile ai fini prognostici o di monitoraggio dell'attività di malattia. L'esito dell'indagine va riportato non solo in termini di positività o negatività ma anche in termini di pattern di reattività secondo la terminologia al momento standardizzata: omogeneo, periferico, nucleolare, punteggiato, anti-centromero). Va tuttavia sottolineato al riguardo che non vi è un'associazione stretta tra tipologia del pattern e specificità anticorpale, l'unica eccezione al riguardo è rappresentata dagli anti-centromero.
Ciascun laboratorio dovrebbe regolarmente includere un controllo positivo ed uno negativo e controllare il proprio metodo utilizzando i sieri di riferimento disponibili presso il CDC di Atlanta (AF-CDC ANA Reference Lab.
Interpretazione dei risultati
Qualora l'esame si ritenga necessario, in una prima fase si effettua un dosaggio del titolo complessivo degli anticorpi antinucleo nel sangue, senza addentrarsi nello specifico delle singole immunoglobuline. Si considerano positivi titoli anticorpali ANA superiori a 1:40 (o a concentrazioni di 5 UI/mL).
Il dosaggio degli anticorpi anti-nucleo è particolarmente sensibile, ma scarsamente specifico. Le patologie autoimmuni possono comportare varie manifestazioni, vaghe e non specifiche. Un risultato negativo al test ANA fa pensare che sia improbabile la presenza di un disordine autoimmune. Se i sintomi ricorrono, però, potrebbe essere utile ripetere l'esame.
Cosa vuol dire essere positivi all’Ana?
La positività al test Ana è un indicatore della presenza di autoanticorpi nell’organismo. Ancora una volta, quindi, è importante ribadire che i soli esiti dei test per gli anticorpi anti nucleo non sono sufficienti per una diagnosi.
Titoli elevati hanno maggiore significatività clinica, poiché titoli bassi (<= 160) possono anche riscontrarsi nei soggetti sani, soprattutto anziani. Un titolo che varia da 1/80 a 1/160 viene considerato debole positivo e, in assenza di una clinica significativa, il dato va monitorato nel tempo. I diversi pattern fluoroscopici, ad eccezione del Centromerico e del PCNA, non sono antigene- o malattia-specifici, ma sono solo indicativi della presenza di ANA.
Si riscontrano ANA positività anche in pazienti con patologie non autoimmuni tipo neoplasie (linfomi, mielomi), insufficienza renale acuta e cronica e infezioni virali ((mononucleosi, HIV), farmaci. ANA positivi possono aversi in patologie autoimmuni Organo-Specifiche contestualmente ad altri autoanticorpi organo-specifici.
L'incidenza di positività per ANA aumenta dopo i 40 anni.
Patologie Autoimmuni e ANA
Le patologie autoimmuni possono comportare varie manifestazioni, vaghe e non specifiche. Alcuni di questi anticorpi sembrano assumere un significato diagnostico e/o prognostico ben specifico in alcune malattie. Le patologie autoimmuni più frequentemente associate alla positività degli ANA sono:
- Malattie autoimmuni sistemiche (LES, Sclerodermia, dermatomiosite, s.
- Altre malattie autoimmuni. Rappresentano uno dei criteri diagnostici.
Gli ANA risultano positivi in circa il 95% delle persone con LES. Dal 60% al 95% delle persone con sclerodermia (o sclerosi sistemica), ha una positività per gli ANA.
Tabella: Peso diagnostico/prognostico della positività per ANA
Questa tabella riassume il peso diagnostico e prognostico della positività per gli anticorpi antinucleo (ANA), basata su linee guida cliniche e studi pubblicati.
| Malattia | Percentuale di positività ANA | Significato clinico |
|---|---|---|
| Lupus Eritematoso Sistemico (LES) | Circa 95% | Supporta la diagnosi, monitoraggio dell'attività della malattia |
| Sclerodermia (Sclerosi Sistemica) | 60-95% | Supporta la diagnosi, utile per sottoclassificare la malattia |
| Sindrome di Sjögren | 50-80% | Supporta la diagnosi, utile in combinazione con altri test |
| Polimiosite/Dermatomiosite | 30-40% | Supporta la diagnosi, meno specifico rispetto ad altre malattie autoimmuni |
| Artrite Reumatoide | 15-35% | Meno specifico, può indicare sovrapposizione con altre malattie |
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