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Esercitazione Vetrini Istologia Online: Una Guida Dettagliata

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L'istologia è la disciplina scientifica che studia i tessuti vegetali e animali. Il materiale istologico deve essere preparato, e per fare questo si incorre in diversi problemi.

Preparazione del Materiale Istologico

La preparazione del materiale istologico è un processo complesso che richiede diversi passaggi fondamentali:

  • Fissazione: Serve a preservare la struttura del tessuto. La formalina aiuta ad evitare la degradazione e deve essere eseguita velocemente prima dell’inizio dell’attività enzimatica. Esistono vari fissativi, tra cui formalina, formaldeide e tetrossido.
  • Inclusione: Prevede prima la disidratazione con l’alcol, la chiarificazione e l’infiltrazione in paraffina (solida a temperatura ambiente).
  • Taglio: Si fa al microtomo o al criostato, che ha una fascia di temperature possibili che dipendono dal tipo di tessuto che si taglia. La luce attraversa solo materiale con spessore molto ridotto, quindi il materiale deve essere sezionato (lo spessore più usato è 4 micron, che si ottiene solo attraverso i microtomi). I tessuti biologici sono molli, quindi prima della sezione deve essere indurito. Per la microscopia ottica si parla di inclusione in paraffina (solida a temperatura ambiente) oppure di congelamento in azoto liquido ad una temperatura di circa -196°. All’interno delle nostre cellule si cerca di evitare la formazione di grossi cristalli di ghiaccio quindi si (i tessuti congelati vengono sezionati con il criostato che ha un microtomo a una temperatura fra -5 e -69 gradi) serve per mantenere la morfologia.
  • Montaggio: Recupero delle sezioni in un bagnetto di acqua, vanno distese altrimenti al microscopio si ha una cattiva messa a fuoco.

Sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica:

  1. Fissazione di un campione di tessuto
  2. Congelamento o inclusione del pezzo
  3. Taglio al microtomo
  4. Montaggio su vetrino
  5. “Bagni” in soluzioni di coloranti
  6. Disidratazione e coverslipping (montaggio)
  7. Osservazione al microscopio ottico

La fissazione viene fatta per immersione e, dopo essere trascorso il tempo necessario, si arriva alla paraffina (fonde a 60° e quando è liquida non si mescola con l'acqua); si deve togliere l’acqua dopo la fissazione, cioè una disidratazione con concentrazione crescente di alcool etilico. Quando dovrò togliere l’alcool utilizzerò lo xilene. Le sezioni non sono idrofile quindi se dopo la colorazione ho ancora acqua devo disidratare ancora fino ad arrivare allo xilene. Alla fine della colorazione la sezione deve avere sopra un vetrino coprioggetto che verrà saldato tramite resina sintetica in modo da sigillare centralmente la sezione.

Colorazione dei Tessuti

I tessuti sono incolori e privi di contrasto, quindi la colorazione serve per aumentare il contrasto e rendere visibili i particolari. I coloranti si comportano come molecole acide o basiche, uno basico legherà molecole acide (basofile) mentre uno acido legherà molecole basiche (acidofile). Per le miscele da ricordare solo la Mallory.

  • Azan Mallory: i nuclei sono colorati con azocarmìno che li colora in rosso, a differenza dei nuclei, le fibre collagene saranno colorate in blu grazie alla miscela di Mallory. Nel tessuto adiposo i nuclei sono rossi (Azan Mallory).
  • Ematossilina eosina: l’ematossilina eosina non è istochimica perché fa vedere componenti in generale, l’istochimica si riflette solo su particolari componenti.
  • Tecniche di impregnazione di argento (istochimica): per vedere i neuroni, il nitrato di argento si lega ai neurofilamenti (una parte del citoscheletro), con questa tecnica si vede, oltre al corpo cellulare, anche dendriti assoni (sono con ematossilina eosina si vede solo il corpo cellulare).
  • Colorazione per lo striscio è la May-Gruwald: Lo striscio di sangue la goccia viene messa su un vetrino, con un altro tiro verso sinistra per creare uno strato di cellule che devono aderire per cui si lascia asciugare lo striscio a temperatura ambiente e si fa una colorazione (i globuli rossi sarebbero trasparenti, il colore deriva dalla massa delle cellule, vedendone una non c'è).
  • Colorazioni istochimiche: Per i lipidi abbiamo Suden 3 che da colore rosso, per i glucidi il reattivo di Schiff che da un colore magenta, il blu di toluidina genera la metacromasia cioè un viraggio di colore, uso un colorante blu ma la matrice della cartilagine si presenta in fucsia per un alto numero di cariche elettriche negative. C’è anche la possibilità di vedere la presenza di enzimi dando il substrato giusto all’enzima. Le fibre mieliniche sono membrane quindi fosfolipidi che vengono individuate con l’SO4. Tecnica di Von Kossa usa il nitrato di argento e fa ottenere colore nero dove ci sono depositi di calcio (tessuto osseo). Per le fibre elastiche uso la resorcina fucsina che colora le fibre elastiche in blu.

Identificazione dei Tessuti

L'identificazione dei tessuti è un'abilità cruciale in istologia. Di seguito, alcuni esempi di tessuti e le loro caratteristiche distintive:

  • Tessuto connettivo fibrillare: Sotto l’epitelio c’è tessuto connettivo fibrillare.
  • Epitelio di rivestimento: In alto ci sono delle linee tutte della stessa altezza che sono cellule epiteliali di rivestimento con nuclei tutti alla stessa altezza; vi è poi una cellula che si colora in modo differente e quindi è una cellula diversa che ha forma di un calice ed è una cellula epiteliale secernente esocrina.
  • Stereociglia: Ingrandimento sulle stereociglia e quindi si tratta di un epitelio
  • Epitelio di transizione o polimorfo: Si riconosce perché ci sono cellule a forma di cupola sullo strato superficiale con nuclei sferici, queste cellule ricoprono le piriformi cioè le cellule sottostanti; l’epitelio non si lacera cambiando la propria superficie interna in base alle esigenze. Sarà alto quando la vescica è vuota e basso quando è piena. Sotto c’è un connettivo fibrillare mediamente denso, negli spazi bianchi del connettivo troviamo la sostanza fondamentale amorfa che non si colora.
  • Ghiandole esocrine: Ghiandola esocrina perché vedo una struttura centrale con cavità molto ampie e un solo strato di cellule di forma cubica, è un dotto escretore. Intorno c’è una confusione ma seguendo i nuclei vedo che la forma è sferica e non sono schiacciati, se sono di forma sferica e questa è una ghiandola allora la struttura circolare con una cavità che nemmeno si vede corrisponde ad un acino; i nuclei sono sferici e quindi le cellule dell’acino sintetizzano siero (se fosse stato muco il nucleo sarebbe stato schiacciato). Tra i vari adenomeri (la maggior parte si vedono male) c’è del tessuto connettivo e quando sono molto uniti fra di loro sono presenti fibre reticolari e quindi collagene di tipo III.
  • Ghiandole sierose e mucose: Presenza di ghiandole mucipare e sierose insieme, colorazione Azan Mallory, le strutture bianche (sono poche) e sono adenomeri a secrezione mucosa, i puntini rossi sono spinti alla base e non sferici; nella parte sierosa i nuclei sono rotondi e il citoplasma è colorato. Si vedono poi 2 dotti escretori di diverso, questo fa presagire la presenza di un dotto principale ramificato (man mano che si ramifica il diametro dei dotti si riduce) la secrezione che prevale è quella sierosa. La parotide è completamente sierosa, la sottomandibolare è prevalentemente sierosa e la sottolinguale è prevalentemente mucosa sono le ghiandole salivari maggiori. Con una secrezione mista possono esserci anche adenomeri misti, quello che produce il siero è la semiluna del giannozzi.
  • Testicolo: Organo parenchimatoso, tubuli seminiferi: Acrosoma spermatozoi, code, S cellule del Sertoli, L cellule di Leydig le ghiandole endocrine interstiziali si possono trovare negli spazi interstiziali tra i tubuli seminiferi del testicolo, oppure nell’ ovaio. Negli spazi interstiziali tra tubuli seminiferi del testicolo ci sono gruppi di cellule dette cellule del Leydig(L) che si dispongono a circondare un capillare, all’ interno del capillare immettono il secreto, testosterone, che favorisce lo sviluppo dei caratteri sessuali maschili e contribuisce alla maturazione degli spermatozoi contenuti all’ interno dei tubuli seminiferi, nel lume del tubulo seminifero si vedono le code degli spermatozoi, mentre le teste sono rivolte verso le cellule del Sertoli (S) che sono cellule più grandi e sono disposte attorno alla parete del tubulo.
  • Surrene: Parte corticale: si suddivide in zona glomerulare, zona fascicolata, zona reticolare. Zona midollare: troviamo le cellule cromaffini, organizzata in cordoni cellulari, la colorazione istochimica permette di evidenziare le cellule cromaffini (C) colorate in marrone che producono adrenalina e noradrenalina.
  • Vasi sanguigni: L'endotelio è costituito come un epitelio pavimentoso monostratificato.

Comprendere le tecniche di preparazione, colorazione e identificazione dei tessuti è fondamentale per chiunque studi istologia. Con la pratica e l'attenzione ai dettagli, è possibile sviluppare le competenze necessarie per analizzare i vetrini istologici e interpretare le strutture cellulari e tissutali.

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