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Preparazione e Analisi di Vetrini Istologici del Polmone

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L'istologia è la branca della medicina che studia i tessuti e le loro anomalie per diagnosticare eventuali malattie. I tessuti sono composti da cellule di forma e funzione differente. L’esame istologico, detto anche istopatologico, è un’analisi condotta al microscopio di campioni di tessuti organici prelevati tramite biopsia, per individuare dei segni e delle alterazioni indici di malattia.

L'esame istologico esamina frammenti del tessuto allo scopo per valutarne la struttura. Chiaramente ogni referto istologico è diverso perché dipende qual è la condizione che si esamina. Si tratta di un test di laboratorio fondamentale per esempio per la diagnosi di tumore, che sia maligno o benigno, ma anche di epatiti (infiammazioni del fegato), di nefriti (infiammazioni del rene), di infezioni dei linfonodi e di diverse malattie della pelle.

L’esame istologico non è sinonimo di esame citologico: l'esame citologico si occupa infatti nel dettaglio dello studio delle cellule del tessuto esaminato, per capire se vi sono in esse delle mutazioni genetiche che indicano la presenza di una malattia. Al contrario, l'esame citologico si basa sullo studio di singole cellule o gruppi di cellule prelevate mediante agoaspirato, scraping o lavaggio di cavità corporee, e si utilizza principalmente per indagini rapide e di screening, come nel caso del Pap-test. L'esame istologico prevede l'analisi di un frammento di tessuto, permettendo una valutazione dettagliata dell'architettura cellulare e della disposizione delle cellule all'interno del tessuto stesso.

Fasi della Preparazione di un Vetrino Istologico

Come si esegue l'esame istologico? La procedura standard prevede diverse fasi cruciali:

  1. Fissazione

    Il primo trattamento a cui un tessuto deve essere sottoposto, dopo essere stato prelevato in vivo tramite biopsia o da cadavere in sede autoptica, è la fissazione. I fissativi possono essere primari, cioè formati da un unico componente (es. formalina, acido picrico, tetrossido di osmio) o essere miscele di composti diversi (es. Bouin, Zenker, Susa) che, sfruttando le diverse caratteristiche dei componenti (come velocità di penetrazione, azione di decalcificazione, affinità per determinati coloranti), possono avere un’azione fissante più adatta agli scopi prefissati.

    Questi composti vengono detti denaturanti quando operano una sorta di coagulazione delle proteine presenti nel tessuto (es. etanolo, acido picrico, cloruro mercurico), o non coagulanti quando agiscono mediante la gelificazione dei vari componenti tissutali, (es. formalina, tetrossido di osmio). I fissativi chimici più usati sono generalmente la paraformaldeide al 2,5% e le miscele di Buoin, di Zenker e di Carnoy.

    Molte volte, alla fissazione chimica viene associata anche la fissazione fisica, per cui il processo di fissazione avviene nel frigorifero o nel freezer. Quando si vuole una risposta molto veloce, per esempio in sala operatoria, o quando si deve assolutamente evitare la denaturazione delle proteine cellulari, si deve fissare tramite congelamento a -80°C con metil butano e azoto liquido e includendo in una resina particolare, l’OCT.

  2. Inclusione

    Con il processo detto inclusione i pezzi anatomici vengono racchiusi in un mezzo indurente il più possibile inerte per poter essere conservati e tagliati in sezioni più o meno sottili. Vi sono molti mezzi includenti a disposizione che vanno scelti volta per volta in base ai metodi di indagine a cui si ricorrerà successivamente. Un parametro molto importante per la scelta del mezzo di inclusione è lo spessore delle sezioni di tessuto che si vogliono ottenere.

    Se si vogliono ottenere delle sezioni semifini, cioè dello spessore di 1-1,5 µm, si include in resine come il glicolmetacrilato (GMA) o il metilmetacrilato (MMA). Se invece abbiamo bisogno di sezioni con spessore dai 3 ai 25 µm l’inclusione viene effettuata utilizzando miscele diverse di paraffine. La scelta delle varie miscele di paraffine, che vanno da un punto di fusione di 50-52°C a uno di 60-62°C, dipende dalle condizioni ambientali, dal tessuto esaminato, dalle sue dimensioni e dal suo grado di durezza. Di norma più un campione è duro e grande più deve essere dura la miscela di paraffine da usare.

  3. Taglio (Sezionamento)

    I blocchetti così preparati devono essere tagliati in sezioni di spessore opportuno per essere poi colorate e analizzate al microscopio. Il sezionamento, è questa la parte più importante dell’intero esame. Consiste nel sezionare il materiale biologico precedentemente trattato in “fette” sottilissime che possano essere osservate anche in controluce.

    La scelta dello strumento di taglio dipende sia dallo spessore che si vuole ottenere che dal tipo di inclusione utilizzato. Per ottenere sezioni semifini si usa l’ultramicrotomo, una speciale versione del microtomo che monta particolari lame in acciaio o diamante. Per sezioni che vanno dai 3 ai 25 µm si utilizza il microtomo, strumento che permette lo scivolamento del blocchetto di inclusione su di una lama. Il sezionamento permette di visionare dettagli minuti della struttura cellulare ingranditi al microscopio ottico o elettronico, e si ottiene attraverso strumenti detti microtomi, in grado di “affettare” il campione in strisce estremamente sottili (nell’ordine di micron-μm) e con un grado di spessore che varia a seconda del tipo di campione e all’esame da effettuare.

    Il taglio sarà effettuato con microtomi rotativi quando i pezzi hanno una dimensione relativamente piccola e taglio sottile (4 - 12 µm), con microtomi a slitta se si tratta di campioni di dimensione e spessore notevoli.

  4. Colorazione

    Con il termine colorazione si indica quel processo in cui le sezioni di tessuto depositate su vetrino vengono fatte reagire con composti diversi che si legano alle componenti del tessuto stesso dando loro una colorazione caratteristica che permette di analizzarne la morfologia. Colorazione, altro passaggio fondamentale per evidenziare tessuti che, per natura, sono pressoché trasparenti e omogenei. I coloranti usati in questa fase dell’esame istopatologico variano a seconda del tipo di campione e al suo Ph.

    Nel corso del tempo sono stati individuati coloranti con caratteristiche diverse (differente colore e/o affinità di reazione) che, anche in combinazione, permettono di analizzare al meglio la morfologia dei vari tessuti.

    • le colorazioni istochimiche, in cui si usano composti chimici che reagiscono con componenti specifiche del tessuto.
    • le colorazioni immunoistochimiche, in cui si usano anticorpi per marcare componenti specifiche del tessuto.

Analisi Microscopica del Tessuto Polmonare

L’aria arriva al tessuto polmonare grazie alla ramificazione della trachea in bronchi, bronchioli e bronchioli terminali che sfociano negli alveoli polmonari. I polmoni sono principalmente composti da alveoli polmonari, sacchetti formati da un sottile tessuto epiteliale che ha il compito di svolgere gli scambi respiratori. Ogni alveolo é circondato da capillari in modo che il sangue possa cedere anidride carbonica e arricchirsi di ossigeno. Le numerosissime e piccole zone bianche sono gli spazi vuoti all’interno degli alveoli.

Durante l'esame microscopico:

  1. Si pone il vetrino sul tavolino portaoggetti e si mette a fuoco con l’obiettivo più piccolo.
  2. Solitamente nel revolver portaobiettivi sono presenti 5 obiettivi: il 4x, il 10x, il 20x, il 40x, il 100x.
  3. Dopo una prima disamina a piccolo ingrandimento si possono usare gli altri ingrandimenti (ad es. tenere presente che per ottenere l’ingrandimento definitivo bisogna moltiplicare la risoluzione dell’oculare (sempre 10x) per quella dei vari obiettivi: quindi osservando con l’obiettivo 4 si avrà un preparato ingrandito di 40 volte (ingrandimento 10 dell’oculare moltiplicato per 4 ingrandimento dell’obbiettivo = ingrandimento 40X). Se osserviamo con obiettivo 10 avremo 100 ingrandimenti e cosi via.

Passando all’ingrandimento x 100 si apprezzano meglio le differenze esistenti tra il tessuto sottile, EPITELIO PAVIMENTOSO MONOSTRATIFICATO, che forma le pareti alveolari, e il più spesso EPITELIO CILINDRICO del bronchiolo. all’ingrandimento x 200 si vede che l’epitelio cilindrico é ciliato. Le cilia, presenti anche nella trachea, hanno il compito di spostare verso l’alto le particelle di sporco o di polvere che sono arrivate fino a qui. Quest’ultimo risulta appoggiato ad uno strato di muscolatura liscia che, quando si contrae nel caso di un attacco di asma, dà un senso di soffocamento chiamato broncospasmo.

Biopsia ed Esame Istologico

Per eseguire un esame istologico serve una minima parte di tessuto da analizzare. La biopsia è il prelievo di quella minima parte di tessuto che serve per fare l’esame istologico. L’esame istologico permette di descrivere colore, le dimensioni e il peso del campione biologico considerato; se si tratta di tumore, in tal caso la stadiazione, ovvero quanto le cellule neoplastiche divergono rispetto a quelle sane in una scala di riferimento e la proliferazione, ovvero la velocità con cui le cellule tumorali si moltiplicano, che ci dice quanto la neoplasia sia aggressiva.

Esistono diverse tecniche di biopsia:

  • La biopsia punch, che si esegue sulla cute tramite piccoli bisturi, per esempio nel caso di nei o macchie sospette della palle.
  • La biopsia con ago aspirato che viene introdotto nella zona da prelevare sotto controllo di ecografia, o TAC o raggi X. Si usa normalmente per prelevare dei noduli al seno o per asportare del tessuto dal midollo osseo.
  • La biopsia di escissione (asportazione), è invece un intervento chirurgico, necessario quando serve prelevare una porzione più consistente per la quale non è possibile usare un’altra tecnica.
  • Infine, un ultimo tipo di biopsia è la biopsia perioperatoria, che viene eseguita in sala operatoria mentre si esegue un intervento per capire la natura del tessuto che si sta operando e capire come proseguire. In questo caso si parla di esame istologico estemporaneo.

Esame Istologico Estemporaneo

In genere si richiede questa urgenza in caso di sospetto tumore rilevato in sede di intervento chirurgico oppure per stabilire l’estensione delle massa e stabilire fino a dopo andare ad incidere e rimuovere. L’esame istologico estemporaneo è un test rapido, dove il campione viene sottoposto a congelamento, sezionato e subito analizzato per definire la tipologia di lesione. Non ha dunque la stessa attendibilità dell’istologico standard, eseguito con le tecniche e i tempi che abbiamo visto, ma consente una prima valutazione che permette all’equipe di decidere seduta stante come procedere con l’intervento che stanno eseguendo.

Indicazioni sulla Preparazione del Paziente e Complicazioni

La preparazione del paziente per il prelievo di un campione tissutale varia in base alla sede e alla tecnica utilizzata per la biopsia. In alcuni casi, il medico potrebbe consigliare di sospendere temporaneamente l'assunzione di farmaci anticoagulanti o antiaggreganti, previo consulto con il medico curante, per ridurre il rischio di sanguinamento. Per biopsie eseguite in anestesia locale, generalmente non è necessaria una preparazione specifica, mentre per procedure più invasive, come una biopsia epatica o polmonare, potrebbe essere richiesto il digiuno nelle ore precedenti l'esame.

Come ogni procedura medica, la biopsia può comportare alcune complicanze, ma è rarissimo che siano gravi. Tra gli effetti collaterali più comuni vi sono il dolore locale e la formazione di ematomi nella zona del prelievo. In alcuni casi, possono verificarsi infezioni, che richiedono trattamento antibiotico. Per biopsie che interessano organi interni, come polmoni o fegato, esiste un piccolissimo rischio di complicanze più gravi, come il pneumotorace (presenza di aria nella cavità pleurica) o emorragie interne.

Se l'esame istologico risulta positivo il paziente viene chiamato a ritirarlo con precedenza rispetto ad altri casi meno urgenti, e possono bastare da pochi giorni ad una settimana.

Esami Complementari

Oltre all'esame istologico, possono essere utilizzati:

  • Le tecniche molecolari usate per analizzare la struttura molecolare dei tessuti.
  • Esami del sangue, sia quelli “standard” che per individuare i “biomarcatori” cioè la presenza di una serie di proteine o DNA che indica la presenza di una certa malattia.
  • I test di imaging, tramite i quali si può avere l’immagine del tumore. Si tratta di strumenti dal funzionamento diverso ma che permettono di individuare una massa, stabilirne le dimensioni e che legami ci sono con gli organi e le strutture vicine.

La diagnosi, cioè il tipo di tumore (maligno/benigno) e la stadiazione, ovvero quanto le cellule neoplastiche divergono rispetto a quelle sane in una scala di riferimento e la proliferazione, ovvero la velocità con cui le cellule tumorali si moltiplicano, che ci dice quanto la neoplasia sia aggressiva.

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