Elettroforesi del DNA: Scopri Tutto Quello Che Devi Sapere in Questa Guida Completa!

L’elettroforesi è una tecnica che consente di separare molecole cariche, in questo caso acidi nucleici, con carica negativa, grazie all’applicazione di un campo elettrico. Essa è utilizzata per separare i frammenti di DNA secondo la loro lunghezza. Così come l’elettroforesi SDS-PAGE è la tecnica d’elezione per l’analisi delle proteine, l’elettroforesi su gel di agarosio costituisce la principale tecnica per l’analisi del DNA. Essa, infatti, ci fornisce un primo approccio con gli esperimenti che stiamo conducendo, ci dà delle prime informazioni importanti che possono essere utili per il proseguo delle indagini molecolari.

Principi Fondamentali dell'Elettroforesi

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa. Molte molecole di interesse biologico (aminoacidi, peptidi, proteine, DNA e RNA) possiedono gruppi ionizzabili nella loro struttura, quindi, ad un opportuno valore di pH, queste sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche. Quando sono poste in un ambiente basico, le proteine si comportano da acidi: il gruppo COOH dei vari amminoacidi che costituiscono la struttura della macromolecola, si dissocia in COO- (particella negativa) e H+ (ione positivo).

Agarosio e Poliacrilammide: Due Matrici per la Separazione

L’agarosio è un polisaccaride formato da lattosio. C’è anche una differenza: l’agarosio è più adatto per frammenti più grandi di DNA; il poliacrilammide, altra sostanza utilizzata nell'elettroforesi, per quelli più piccoli, a causa delle maglie più piccole.

L’agarosio è il polimero di una molecola (l’agar-agar) estratta da un’alga, si presenta come polvere solubile in soluzione acquosa ad alte temperature, che solidifica formando un gel una volta raffreddatosi. La soluzione acquosa in cui si fa solitamente sciogliere l’agarosio è il TAE buffer (Tris-Acetato-EDTA). Bisogna specificare, però, che il TAE non è l’unico buffer che può essere usato, esistono altri tipi di buffer in cui l’acetato viene sostituito con altri sali (ad esempio il TBE, in cui la B sta per Borato).

Una volta preparato il buffer TAE (che normalmente si prepara ad una concentrazione di 50X e si usa alla concentrazione 1X), bisogna sciogliervi dentro la polvere alla concentrazione desiderata. La concentrazione di agarosio dipende dal tipo di DNA che si vuole analizzare, dal momento che essa determina la larghezza delle maglie del gel all’interno del quale si muoveranno le molecole di agarosio. Se, ad esempio, ci troviamo nella situazione di dovere analizzare DNA genomico, bisogna scegliere una concentrazione di agarosio non troppo alta (in genere circa 0.8% p/V), in modo da creare delle maglie larghe che permettano il passaggio del DNA genomico di dimensioni elevate. Se, invece, si sta analizzando un prodotto PCR, allora si sceglierà una concentrazione di agarosio più alta, in modo da creare delle maglie piccole e aumentare la risoluzione.

Il Ruolo del Campo Elettrico

Si parla di corrente perché, trattandosi di elettroforesi, la tecnica sfrutta il movimento di molecole cariche in presenza di un campo elettrico. Nel caso del DNA, grazie ai gruppi fosfato, la molecola presenta delle cariche negative, per cui il suo movimento avverrà dal polo negativo a quello positivo. A pH neutro il DNA è carico negativamente grazie alla presenza dei gruppi fosfato: i frammenti di DNA vengono quindi attratti verso il polo positivo del campo elettrico.

I frammenti di DNA carichi negativamente, vengono attratti positivamente con un campo magnetico. I poli più lunghi si fermano prima (per attrito). Si ha quindi una separazione tra frammenti.

Elettroforesi su Gel di Agarosio: Una Tecnica Dettagliata

L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.

L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici.

Fattori che Influenzano la Velocità di Migrazione

Fattori che fanno variare la velocità di migrazione sono:

Peso molecolare
Concentrazione di agarosio
Conformazione DNA
Voltaggio applicato
Intercalanti
Tampone di elettroforesi

Preparazione del Gel e Caricamento del DNA

Una volta pesato, fatto sciogliere l’agarosio in TAE dentro un forno a microonde e lasciato raffreddare la soluzione per qualche attimo, si aggiunge un colorante (in genere un intercalante del DNA) che, sottoposto all’azione dei raggi UV, permetta di vedere le bande di DNA su gel. A questo punto è possibile versare la soluzione in un supporto orizzontale precedentemente preparato, a cui è stato applicato un “pettinino” per formare i pozzetti. Dopo qualche minuto, la soluzione si sarà solidificata e il gel sarà pronto. Non resta altro che caricare il nostro DNA, e per fare ciò è sufficiente rimuovere il piccolo pettine e pipettare dentro ai pozzetti formatisi il nostro campione addizionato di un buffer di caricamento. È inoltre molto importante caricare un ladder, ovvero un marker a peso molecolare noto che ci renda coscienti del range all’interno del quale si trovano le bande che otteniamo.

Esso è posto in uno stampo di forma rettangolare, fornito di alcune cavità chiamate pozzetti, entro i quali viene deposta una miscela di frammenti di restrizione.

Coloranti e Visualizzazione del DNA

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l’etidio bromuro. Questa molecola planare si inserisce (intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette luce fluorescente quando irradiata con luce ultravioletta (300 nm). L’etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), al campione, o, alternativamente, dopo l’elettroforesi. Il colorante storicamente più usato è l’Etidio Bromuro, molecola altamente tossica che si sospetta essere anche cancerogena. Ad oggi esistono delle valide alternative a più basso tasso di tossicità come il GelRed.

Quando la corsa elettroforetica è terminata, ciò che rimane da fare è porre il gel su un transilluminatore che, grazie alla luce UV, ci permetta di vedere le nostre bande.

Applicazioni dell'Elettroforesi del DNA

Come detto, il gel d’agarosio è una delle tecniche più usate perché applicabile ad ambiti diversissimi. Le lastre per confrontare il DNA sono spesso ottenute dall’elettroforesi, o sono l’elettroforesi stessa. Ci sono delle sequenze con lunghezza caratteristica in ognuno di noi. È come se fossero una nostra impronta digitale; è molto difficile che i segmenti abbiano la stessa lunghezza. Per accertarsi dell’identità di un soggetto bisogna tagliare più enzimi di restrizione.

In ogni laboratorio di biologia molecolare o in ogni laboratorio in cui si abbia a che fare con DNA, tutti i giorni gli operatori ricorrono ai gel di agarosio.

Elettroforesi su Gel di Acrilammide

L'elettroforesi su gel di acrilammide (PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis) è una tecnica che serve principalmente per analizzare e separare le proteine, sfruttando le dimensioni e la carica delle proteine stesse.