Elettroforesi su Gel di Agarosio: Scopri i Segreti, Principi e Applicazioni Indispensabili!

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa.

Elettroforesi su Gel di Agarosio

L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.

L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici.

Fattori che influenzano la velocità di migrazione

Peso molecolare
Concentrazione di agarosio
Conformazione DNA
Voltaggio applicato
Intercalanti
Tampone di elettroforesi

Visualizzazione degli Acidi Nucleici

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l’etidio bromuro. Questa molecola planare si inserisce (intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette luce fluorescente quando irradiata con luce ultravioletta (300 nm). L’etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), al campione, o, alternativamente, dopo l’elettroforesi.

Elettroforesi degli Acidi Nucleici

L’elettroforesi degli acidi nucleici viene principalmente utilizzata per l’analisi di frammenti di DNA. Questa segue gli stessi principi elettrochimici dell’elettroforesi proteica anche se prevede metodiche leggermente differenti. Data la struttura di base di DNA e RNA, infatti, essendo i nucleotidi composti da una molecola di ribosio, una base azotata e un fosfato, le molecole sono necessariamente a carica fortemente negativa. Altra differenza sta nella posizione della cella elettrolitica: se nel caso dell’elettroforesi proteica il gel di acrilamide viene posto verticalmente, nel caso si analizzino acidi nucleici il gel di agarosio si dispone orizzontalmente. Nel caso di elettroforesi di DNA, inoltre, si utilizzano enzimi di restrizione e quindi proteine appartenenti alla classe delle idrolasi: si tratta di deossiribonucleasi II sito-specifiche. Questi enzimi sono capaci di frammentare il doppio filamento del DNA agendo in modo da tagliare entrambi i filamenti ad una stessa altezza.

Per quanto riguarda la visualizzazione dello spettro elettroforetico finale, nel caso degli acidi nucleici non si utilizzano coloranti semplici come nel caso delle proteine, bensì composti che in genere risultano agenti intercalanti per il genoma stesso. Il più utilizzato è il bromuro di etidio. Questa molecola, completamente planare, possiede atomi tutti ibridizzati sp2 grazie ai doppi legami coniugati che li uniscono. Si presenta così di spessore paragonabile a quello delle basi azotate fra le quali può incunearsi (intercalare): una volta che il bromuro di etidio intercala, la fluorescenza della sezione di DNA se illuminato da raggi UV aumenta di circa 100 volte.

L’elettroforesi degli acidi nucleici utilizza una matrice diversa che si compone di gel di agarosio. L’elettroforesi su gel di agarosio è utile per analizzare la grandezza dei singoli frammenti di DNA e per andare a valutare la presenza di specifiche sequenze di DNA. Per analizzare la dimensione dei frammenti si utilizza una soluzione, da inserire nel primo pozzetto, contenente frammenti DNA di dimensioni note. Per quanto riguarda la presenza di specifiche sequenze di DNA, invece, si utilizzano tecniche specifiche che sfruttano sonde a DNA marcate con sostanze radioattive. Il campione di DNA è denaturato quando è ancora immobilizzato nel gel e viene poi esposto a sonde specifiche marcate con elementi radioattivi: in questo modo le sonde si legheranno ai singoli filamenti ad esse complementari così che specifiche sequenze possano essere ritrovate nel gel.