Citologia Vaginale nel Cane: Guida Completa per Interpretare le Fasi del Ciclo Estrale

A partire dal lupo, il cane dei nostri giorni ha subito numerosi e profondi cambiamenti che non hanno interessato solamente le dimensioni e le caratteristiche fisiche esterne, ma anche il comportamento, le abitudini, l’alimentazione e, ovviamente, i cicli riproduttivi. Il lupo è un animale stagionale: le femmine hanno un solo periodo estrale per anno (da gennaio a marzo) durante il quale il maschio produce spermatozoi. L’addomesticamento ha portato invece le femmine ad avere fino a due o tre cicli l’anno e i maschi ad essere sempre fertili.

La femmina di cane domestico è tradizionalmente considerata un animale monoestrale non stagionale: un unico ciclo nel periodo riproduttivo. Ormai il cane domestico è poco influenzato dal fotoperiodo e può presentare calori in qualsiasi mese dell’anno (con incidenza maggiore nei mesi primaverili a luminosità crescente).

Il periodo estrale è perciò seguito da un lungo periodo di quiescenza. Sono stati fatti molti studi riguardanti i fattori che intervengono nel determinare la durata di questo periodo interestrale (come la razza, l’età, le dimensioni, la stagione..) ma i risultati sono spesso contradditori. La media della durata dell’intervallo tra i cicli ovarici è di 7,5 mesi, con quindi due calori l’anno (esistono ovviamente le eccezioni: Basenji, Boston Terrier e Dingo presentano un solo calore l’anno, il Pastore Tedesco arriva facilmente a tre).

Durata Media del Periodo Interestrale in Diverse Razze

In tabella è riportata la durata media e le variazioni del periodo interestrale delle diverse razze (da Christie e Bell).

Razza	Media	Variazione
Pastore Tedesco	262	2-30
Beagle	34	30-40
Boxer	34	30,5-42,6
Cavalier King	34	30-36
Chihuahua	31	-
Cocker spaniel	32	26-39
Bassotto nano	33,5	29-41
Golden retriever	33	27-39,5
Labrador retriever	29	25-34
Pechinese	29	26-32
Spitz tedesco	27	-
Barbone nano	27	24-32
Scottish terrier	28	26-31
Yorkshire terrier	32	31-34

Il ciclo estrale si compone di quattro fasi: PROESTRO, ESTRO, DIESTRO e ANESTRO.

ANESTRO

È la fase di quiescenza sessuale che si instaura al termine della stagione riproduttiva. Durante questa fase la femmina non esercita attrazione sui maschi e non esprime sintomi di estro o di attività ovarica. Si protrae quindi dal termine del diestro all’inizio del successivo proestro.

Il progesterone, l’LH e gli estrogeni sono a livello basale per tutta la durata mentre l’FSH presenta valori più elevati in questo stadio rispetto al proestro. Nel tardo anestro iniziano ad aumentare l’LH e gli estrogeni.

Citologicamente troveremo una bassa cellularità, costituita soprattutto da cellule basali e intermedie piccole.

PROESTRO

È la fase del ciclo in cui la femmina inizia a manifestare i segni clinici riferibili al calore, che vanno ad intensificarsi fino a raggiungere la massima intensità durante la fase dell’estro. Dura mediamente 9 giorni (con variazioni dai 3 ai 21). In questa fase del ciclo, la vulva aumenta di volume, appare turgida ed iperemica e sono presenti le perdite vaginali siero-ematiche.

Alcuni giorni prima dei segni visibili del proestro gli animali possono essere svogliati e indifferenti, alcune rifiutano il cibo. Il proestro è caratterizzato poi da un cambiamento di carattere della cagna: è più agitata e nervosa, tende a vagabondare e marcare il territorio con le urine. Beve abbondantemente e urina frequentemente. Inizia ad esercitare una certa attrazione sui maschi, ma non accetta la monta (nello scolo vaginale infatti sono presenti ferormoni come il metil-p-idrossibenzoato che richiamano i maschi). In questo periodo stimolando la cute circostante alla vulva possiamo ottenere tre riflessi: contrazioni vulvari, deviazione della coda e curvatura delle zampe posteriori.

Il proestro termina quando la femmina si concede al maschio per l’accoppiamento. Fisiologicamente questo periodo si caratterizza per lo sviluppo dei follicoli ovarici, indotto dagli ormoni luteinizzante (LH) e follicolo stimolante (FSH) prodotti dall’ipofisi, a sua volta stimolata dal GnRh (Gonadotropine Releasing Hormone) liberato dall’ipotalamo. Aumenta la produzione di estradiolo da parte dei follicoli in accrescimento che causa le modificazioni comportamentali e organiche della cagna. L’estradiolo stimola la proliferazione e la corneificazione dell’epitelio vaginale e la desquamazione delle cellule cornificate e provoca la ritenzione di liquidi alla base dell’aumento di volume e del turgore della vulva. Agisce anche a livello delle gap-junction delle cellule endoteliali dei capillari della mucosa uterina, facilitando il passaggio delle cellule ematiche nel lume vaginale, rilevabile macroscopicamente come scolo vulvare siero-ematico.

I cambiamenti caratteriali delle femmine sono dovuti anche all’aumento del testosterone in tardo proestro (incremento da raggiungere livelli simili a quelli di un cane maschio intero, circa 0,3-1 ng/ml). Nella cagna il progesterone rimane a livello basale (<1-2 ng/ml) fino alla fine del proestro, quando comincia ad aumentare comportando la luteinizzazione preovulatoria dei follicoli tipica di questa specie. Contemporaneamente c’è un calo del tasso di estrogeni, fondamentale per l’inizio della recettività all’accoppiamento.

La concentrazione sierica di LH rimane vicino al livello basale per tutto il proestro, mentre la produzione di FSH si riduce a causa del feedback negativo che l’inibina prodotta dai follicoli provoca sul rilascio dell’ormone.

Lo striscio vaginale che si ottiene all’inizio del proestro si caratterizza da cellule basali-parabasali e intermedie piccole. Ben rilevabili saranno gli eritrociti. Con l’avanzare della fase, si avrà una riduzione della percentuale delle cellule para basali e intermedie piccole e un aumento delle cellule intermedie grandi e superficiali, che saranno dominanti nell’estro.

ESTRO

L’estro ha una durata media di 9 giorni (con un range variabile da 4 a 24 giorni). È la fase del ciclo in cui la femmina accetta l’accoppiamento con il maschio. Alla pubertà solitamente la durata è più lunga rispetto alla media.

La cagna mostra interesse verso il maschio rimanendo ferma e deviando lateralmente o verso l’alto la coda. L’edema vulvare è ancora presente ma il flusso vaginale cambia da rosso sangue ad incolore e chiaro o giallo paglierino.

L’accoppiamento ha rituali precisi, caratteristici di ogni specie. Quando la femmina si mostra disposta alla copula, il maschio la monta e una volta avvenuta la penetrazione il bulbo del pene s’ingrossa formando il cosiddetto “nodo interno”. Emesse le prime due frazioni di sperma, il maschio scavalca la compagna mantenendo il pene in erezione all’interno della vagina e si dispone con il posteriore contro il posteriore della femmina fino al termine della copula.

L’ovulazione si verifica 2-3 giorni dopo il picco di LH, che a sua volta avviene in genere 1-2 giorni dopo il picco degli estrogeni in tardo proestro. L’inizio dell’estro varia rispetto al picco di LH: in certe cagne può essere 2-3 giorni prima, in altre 4-5 giorni dopo. In generale l’ovulazione avviene da 1 a 3 giorni dopo la prima accettazione del maschio. Ad ogni ovulazione scoppiano dai 4 ai 6 follicoli.

La particolarità di questa specie è quella di ovulare un oocita immaturo, fermo allo stadio di metafase II. La fecondazione perciò potrà avvenire solo al termine della seconda divisione meiotica, processo che si attua nell’ovidotto 48-60 ore dopo l’ovulazione. In seguito l’oocita rimane fecondabile per 48 ore. Gli spermatozoi sopravvivono a lungo nell’apparato genitale della femmina (si sono ritrovati spermatozoi mobili fino a 268 ore dall’accoppiamento). È possibile che una femmina coperta al primo giorno di estro possa presentare nell’utero spermatozoi fertili per la maggior parte del periodo estrale. Il fatto che gli spermatozoi possano sopravvivere così a lungo spiega anche il fenomeno della superfecondazione.

Avvenuta l’ovulazione, la cagna entra in una fase luteinica di diestro gravidico o non gravidico, a seconda che ci sia stata o meno la fecondazione.

La concentrazione sierica di estrogeni scende durante tutto l’estro ed abbiamo il picco di LH.

Il picco di LH stimola la ripresa della progressione meiotica del follicolo dallo stadio di profase e la liberazione da parte delle cellule della granulosa di certe sostanze, come le prostaglandine, favorenti la deiscenza del follicolo stesso.

Il picco dura 24-72 ore e poi decresce fino a livello basale. È troppo breve per essere utilizzato come parametro nella determinazione dell’ovulazione. Si utilizza invece la concentrazione del progesterone ematico, associato alla citologia vaginale per individuare il momento migliore per l’accoppiamento.

Dall’aumento del progesterone a valori maggiori di 1-2 ng/ml trascorrono 24-48 ore prima del picco di LH ed altre 24-48 ore dall’ovulazione, in seguito alla quale l’oocita necessita di ulteriori 48-72 ore per maturare e rimane fecondabile per 48 ore. Significa che la giornata ideale per l’accoppiamento è la quarta-quinta giornata dopo l’aumento del progesterone. Valori di progesterone pari a 4-10 ng/ml vengono raggiunti in corrispondenza dell’ovulazione, in seguito l’ormone aumenta per tutto l’estro.

Citologicamente a livello vaginale abbiamo un aumento delle cellule superficiali a discapito di quelle intermedie grandi e piccole. Queste cellule sono squame, cellule degenerate esfoliate nel lume vaginale. Questa è la fase dominata dal progesterone, prodotto in notevole quantità dai corpi lutei.

DIESTRO

A seconda che sia avvenuta o meno la fecondazione, si distingue un diestro gravidico da uno non gravidico, di durata quest’ultimo di circa 70-75 giorni.

In questo stadio non abbiamo recettività alla monta da parte della femmina e scompaiono tutte le variazioni comportamentali tipiche del calore. Via via si attenuano le modificazioni organiche date dagli estrogeni: si attenuano le dimensioni della vulva e lo scolo vaginale è assente (anche se possiamo ritrovare perdite vulvari chiare o ematopurulente nei primi giorni di diestro).

L’unico metodo per individuare precisamente l’inizio del diestro è la citologia vaginale: nel primo giorno abbiamo un crollo marcato (dal 20 al 50%) della percentuale di cellule superficiali che lasciano il posto a cellule intermedie e para basali, frammiste a una quantità variabile di neutrofili. È utile individuare l’inizio di questo per prevedere la data del parto e valutare se l’accoppiamento o l’inseminazione è andata a buon fine.

L’intervallo tra il primo giorno di diestro (D1) e il parto è di 56-57 giorni. La lunghezza della fase luteinica è correlata alla maggiore longevità del corpo luteo che non subisce luteolisi acuta da parte delle prostaglandine (come nella cavalla, bovina e pecora) ma regredisce spontaneamente. In questa fase infatti un’isterectomia effettuata durante il diestro non incide sulla durata di questo stadio.

Il progesterone, dominante in questa fase promuove nell’animale, gravidico oppure no, una serie di eventi atti a mantenere la gravidanza, come la produzione da parte delle ghiandole endometri ali di metaboliti importanti per lo sviluppo zigote (cosiddetto latte uterino), la prevenzione della contrattilità uterina, la chiusura della cervice e lo sviluppo delle mammelle.

Importanza della Citologia Vaginale e del Dosaggio Ormonale

Dal riconoscimento del momento dell’ovulazione dipende il successo dell’accoppiamento. Il veterinario che si occupa di problemi di allevamento ha due metodi per determinare il giorno ovulatorio della fattrice:

esame citologico delle cellule vaginali esfoliate (striscio vaginale)
determinazione dei livelli sierici del progesterone

Esame Citologico (Striscio Vaginale)

Gli strisci vaginali sono facili da eseguire e poco costosi.

PROESTRO: inizia con la perdita delle prime gocce di sangue e si conclude il primo giorno in cui la femmina accetta il maschio. Mediamente dura 9 giorni (3-17 giorni). La femmina attira i maschi ma se questi le si avvicinano li respinge ringhiando. Le perdite vaginali sono di colore rosso vivo. Dal punto di vista citologico il vetrino mostra cellule rotonde od ovali con grandi nuclei e sono presenti numerosi globuli rossi.
ESTRO: inizia il primo giorno in cui la femmina accetta il maschio e termina il primo giorno in cui lo rifiuta. Mediamente dura 9 giorni (3-21 giorni). La femmina accetta il maschio, inarca il dorso, devia la coda di lato e rimane ferma quando il maschio cerca di montarla. Le perdite diminuiscono progressivamente e passano dal rosso al rosa. L’ovulazione avviene durante l’estro ma con l’esame colpocitologico (vetrino) il momento si può solo presumere. Mitologicamente diminuiscono o scompaiono i globuli rossi e le cellule epiteliali si corneificano e perdono il nucleo. All’apice della fase estrale sono visibili solo cellule epiteliali cornificate.

Ma la comparsa della massima corneificazione delle cellule vaginali varia da una cagna all’altra e può avere un’oscillazione anche di alcuni giorni rispetto all’ovulazione. Dunque l’esame citologico dell’epitelio vaginale da solo, non è un indice accurato dell’ovulazione della cagna ma rimane comunque una metodica importante per valutare la progressione del ciclo estrale e per determinare il momento più adatto per cominciare la misurazione dei livelli sierici del progesterone.

DIESTRO: inizia il primo giorno in cui la femmina rifiuta di nuovo il maschio e si conclude dopo circa 9 settimane.

Come Determinare il Momento Ideale per l'Accoppiamento

È fondamentale saper scegliere il momento ideale per la monta: si aumentano così le probabilità di successo, ovvero una gravidanza. Il fatto è che il ciclo estrale della cagna è composto da diverse fasi. Ciascuna di queste fasi ha un range di durata che non è identico in tutte le cagne. Pensiamo alla prima fase, quella del proestro, cioè delle perdite vaginali ematiche con vulva ingrossata: dura in media 9-10 giorni, ma ha un range che varia dai 3 ai 17 giorni. Con cagne che continuano ad avere perdite anche durante la fase estrale vera e propria.

Non ha senso dire "La cagna va fatta accoppiare il giorno tot e tot dopo l'inizio delle perdite", perché ogni cagna avrà un ciclo leggermente diverso e ciò che va bene per una, non vuol dire che vada bene per un'altra.

Per sapere quale sia il momento migliore per far accoppiare la cagna, è necessario riuscire a individuare il più precisamente possibile il momento dell'ovulazione. E per fare questo, è possibile ricorrere a diversi test.

Esame Citologico

L'esame maggiormente noto a tutti è lo striscio vaginale: si tratta di un esame citologico che esamina le cellule vaginali presenti in quel momento. È il metodo più rapido ed economico, ma anche il meno preciso, soprattutto quando viene richiesto un singolo striscio o quando non sia abbinato a uno degli altri metodi. Con lo striscio vaginale è possibile valutare se si sia nella fase estrale, cioè quando la maggior parte delle cellule vaginali ha perso il nucleo diventando un epitelio corneificato o se si sia in una fase di proestro o diestro, cioè quando la maggior parte delle cellule sono nucleate o non corneificate.

Con un singolo striscio, però, non si può dire molto di più: il veterinario potrà dirvi ok, siamo in fase estrale, ma niente altro (oltre a controllare che non ci siano segni di infezioni batteriche). Se già gli strisci vaginali sono ripetuti a distanza di tot giorni, si può dire come si stia modificando l'epitelio vaginale. Questo serve soprattutto per capire se da un proestro stiamo andando verso un estro o se da un diestro stiamo andando in anestro, in quanto sia nel proestro che nel diestro sono presenti le cellule nucleate.

Quello che il veterinario non potrà dirvi con il semplice striscio vaginale è quando sarà l'esatto momento dell'ovulazione.

Dosaggio del Progesterone

Una metodica un po' più precisa, soprattutto se abbinata allo striscio vaginale, è la determinazione dei livelli ematici di progesterone. A seconda del laboratorio di riferimento, i dati che vi forniremo possono variare un pochino, quindi bisogna sempre fare riferimento agli schemi dei singoli laboratori di analisi veterinarie, ma in generale bisogna considerare che durante le fasi di proestro e di anestro il progesterone è inferiore a 1 microgrammo/ml.

Durante l'estro, invece, i follicoli luteinizzati cominciano a secernerlo e la concentrazione sale fino ad arrivare a 4-8 microgrammi/ml quando si ha l'ovulazione vera e propria. In generale si dice che il momento giusto per far accoppiare la cagna sia il secondo giorno dopo l'ovulazione. Per questo motivo, se facciamo il dosaggio del progesterone e arriviamo a 4 microgrammi/ml, vuol dire che abbiamo due giorni di tempo per far accoppiare la cagna nel periodo più fertile. Anche in questo caso però, non basta un singolo dosaggio, ma potrebbero esserne richiesti diversi anche perché non è che il progesterone sale di una quantità specifica a seconda del giorno.

Questo potrebbe essere uno schema ideale di interpretazione dei livelli del progesterone (solitamente i laboratori, quando si effettua la progesteronemia, forniscono il loro schema di controllo):

progesterone > 1 microgrammo/ml: siamo in proestro o anestro
progesterone fra 1 e 1,9 microgrammi/ml: ovulazione entro 3 giorni
progesterone fra 2 e 2,9 microgrammi/ml: ovulazione entro 2 giorni
progesterone fra 3 e 3,9 microgrammi/ml: ovulazione entro 1 giorno
progesterone fra 4 e 8 microgrammi/ml: ovulazione
progesterone > di 8 microgrammi/ml: se abbiamo cellule corneificate siamo 1-5 giorni dopo l'ovulazione, se non ci sono cellule corneificate siamo in diestro

Questo, invece, è un altro schema di stadiazione dell'estro tramite la misurazione del progesterone, questa volta considerato in ng/ml:

progesterone < 1 ng/ml: proestro, anestro o estro in fase pre-ovulatoria
progesterone 2-25 ng/ml: estro e fase post-ovulatoria
progesterone 10-15 ng/ml: momento ideale per la monta
progesterone 25-50 ng/ml: diestro o gravidanza

Dosaggio dell'LH

Un altro dosaggio molto utile e molto più preciso per individuare il momento dell'ovulazione è il dosaggio dell'LH, esame però che non tutti i laboratori fanno. L'LH aumenta in maniera notevole da valori basali < 1 ng/ml durante la fase follicolare. Visto che il picco dell'LH causa l'ovulazione, questo vuol dire che riuscire a individuare tale picco vuol dire trovare il preciso momento dell'ovulazione.

Associare citologia vaginale, progesteronemia e dosaggio dell'LH è il metodo più sicuro per scoprire il momento giusto in cui far accoppiare la cagna. Il dosaggio dell'LH deve essere sempre accompagnato dall'esame del progesterone in quanto consente di essere sicuri che l'ovulazione sia avvenuta davvero. Questo perché ci sono cagne nelle quali si ha il picco di LH, ma non ovulano e quindi il progesterone non sale.

Nel caso dell'LH, un possibile protocollo sarebbe questo:

il quarto-quinto giorno di proestro (individuato tramite esame citologico), cioè quando almeno metà delle cellule sono anucleate e corneificate, iniziare a fare i prelievi, sempre alla stessa ora. Questo primo prelievo andrà eseguito insieme a una progesteronemia per essere sicuri di essere nella fase giusta con progesterone < 1 ng/ml
effettuare prelievi giornalieri fino a individuare il picco
entro 3 giorni, il progesterone dovrebbe essere > 2 ng/ml
il periodo più fertile è 1-2 giorni dopo l'ovulazione

Quando Far Accoppiare la Cagna?

Alla luce di quanto detto, per cercare di far accoppiare nel momento ideale la cagna si potrebbe:

fare uno striscio vaginale almeno a giorni alterni da quando si vedono le perdite ematiche
una volta individuato l'inizio dell'estro con la comparsa delle cellule corneificate, effettuare dosaggi del progesterone almeno a giorni alterni fino ad ottenere un valore fra 4 e 8 microgrammi/l per capire quando sia il momento dell'ovulazione.