Protocollo Definitivo per la Colorazione con Blu di Toluidina: Guida Completa e Facile

L’allestimento di preparati microscopici implica una serie di operazioni che consistono in: prelievo di frammenti d’organo, fissazione, inclusione e colorazione.

Prelievo e Fissazione dei Frammenti d’Organo

Il prelievo di frammenti d’organo va condotto al più presto sul materiale fresco. Se, in teoria, i metodi di osservazione delle cellule allo stato vitale sarebbero da preferirsi in quanto consentono uno studio dinamico della cellula, in assenza di artefatti di immagine prodotti dalle fasi successive di allestimento del campione, in realtà il loro impiego è limitato perché le cellule ed i tessuti isolati dall’organismo non sopravvivono che per tempi brevi (a meno che non siano coltivati in vitro) in quanto gli enzimi litici intracellulari si attivano rapidamente e distruggono la cellula (autolisi) provocando gravi alterazioni di struttura.

In secondo luogo, frammenti spessi di tessuto non permettono un’analisi citologica fine e quindi diventa necessario lavorare con tessuti uccisi chimicamente, prima che intervengano gli enzimi autolitici, e tagliarli in sezioni sottili che possano essere osservate al microscopio, eventualmente previa colorazione.

La fissazione consiste nel trattamento del frammento d’organo con procedimenti chimici o fisici capaci di preservare e stabilizzare i costituenti dei tessuti, inattivando nel contempo gli enzimi autolitici. La fissazione dura da pochi minuti fino a 24-48 ore a seconda della grandezza del frammento. Il rapporto fissativo/campione deve essere di 20:1. La fissazione di organi interi non è in genere buona norma, in quanto, a parte l’impossibilità di alcune situazioni, la penetrazione lenta del liquido ha l’inconveniente di permettere l’autolisi delle parti che tardivamente vengono a contatto col fissativo.

Ogni fissativo all’atto di provvedere alla stabilizzazione delle strutture provoca degli artefatti di struttura, ossia immagini inesistenti prima della fissazione. Nella scelta di un fissativo va anche tenuto presente che esso non deve svolgere azione estrattiva sui componenti che si desiderano identificare. I fissativi maggiormente usati sono la formaldeide (o formalina) al 10% e l’alcool etilico a 90°. Soprattutto la prima viene particolarmente raccomandata in quanto consente la realizzazione dei più comuni metodi di colorazione per uso diagnostico. È maggiormente usata la formalina tamponata per evitare variazioni di pH che possano alterare le proprietà antigeniche di alcuni antigeni.

Bisogna considerare che nel caso si vogliano effettuare studi immunoistochimici, la formalina richiede successive tecniche di smascheramento antigenico in quanto questo fissativo crea ponti metilenici con le proteine alterandone la struttura. La formaldeide non permette di scendere all’individuazione di fini dettagli citologici, dato che le cellule vanno incontro a raggrinzamenti e retrazioni. Ne consegue che per indagini analitiche si consigliano altri fissativi o, meglio, miscele di fissativi. Per fissare il tessuto, infine, spesso si usano miscele di varie sostanze; le più note sono: miscela di Bouin, di Zenker, di Susa, di Carnoy e di Orth.

Alcuni fissativi fungono anche da coloranti come nel caso dell’acido osmico, usato per la dimostrazione dei lipidi. Una tecnica di fissazione molto utilizzata è il congelamento-essiccamento: si ricopre il materiale da fissare con una resina e lo si espone a vapori di azoto liquido alla temperatura di -170 - -190 °C, completando l’operazione a -30 - -40 °C. Questa tecnica ha il vantaggio di una rapida fissazione e non necessita di una successiva fase di smascheramento antigenico se si vogliono usare tecniche immunoistochimiche.

L’aldeide formica ha un forte odore e per evitare danni all’apparato respiratorio conseguenti alla sua inalazione, si devono usare cappe o almeno tenere aperte le finestre. È cancerogena per le vie respiratorie e teratogena, cioè danneggia il feto nel 1° trimestre di gravidanza. Non bisogna mai usare la soluzione fisiologica in quanto l’acqua entrerebbe nelle cellule per osmosi facendole scoppiare. Altri fissativi sono: gluteraldeide, cloruro di mercurio, acido picrico. I migliori fissativi sono quelli che determinano una precipitazione dei componenti cellulari in minutissimi granuli.

I fissativi contenenti acidi (come l’acido picrico) sono molto penetranti e molto rapidi, ma determinano l’addensamento della struttura nucleare. Ciò comporta che il metodo venga di volta in volta scelto opportunamente in rapporto al tipo di strutture che si desiderano studiare e, di conseguenza, alla colorazione da adottare.

Inclusione del Tessuto

L’inclusione consiste nel lasciar permeare il tessuto da una sostanza che solidifica a temperatura ambiente atta a consentire il taglio in sezioni sottili dello spessore di pochi micron. Essa è correntemente rappresentata dalla paraffina. Trattandosi di una sostanza idrofoba, la sua penetrazione richiede che dal tessuto venga allontanata l’acqua a mezzo di un disidratante. Si usa all’uopo una serie di soluzioni di alcool etilico a gradazione crescente fino a portare il pezzo in alcool assoluto. Da qui il tessuto viene trasferito in un solvente della paraffina che di solito è lo xilolo.

Esso ha la funzione di consentire la penetrazione del mezzo includente. La paraffina, il cui punto di fusione varia tra 52 e 60 °C, è usata allo stato liquido, quindi l’operazione viene praticata in termostato. Una volta che la compenetrazione è avvenuta, il pezzo viene rapidamente raffreddato, così da acquistare la consistenza della paraffina solida. Del tessuto incluso si ottengono fette di 3-10 µm, usando un microtomo a lama d’acciaio. Data la sottigliezza, queste risultano difficilmente maneggevoli, quindi vengono montate su un vetrino portaoggetto.

Per provvedere alla loro colorazione si suole allontanare la paraffina e riportare il tessuto al suo primitivo stato d’idratazione. Così le sezioni vengono dapprima immerse in xilolo, quindi in una serie di soluzioni di alcool a gradazione decrescente fino all’acqua. A questo punto si può procedere alla colorazione e al montaggio, ossia all’applicazione di un vetrino coprioggetto che viene fatto aderire al primo mediante una resina naturale o sintetica.

Un’inclusione in un materiale più duro può essere ottenuta utilizzando plastiche quali resina epossidica. L’infiltrazione del frammento da includere viene fatta con plastica allo stato momomerico nel quale essa è fluida; viene quindi indotta la solidificazione del frammento infiltrato facendo polimerizzare la plastica mediante calore o raggi ultravioletti. Trattandosi di un materiale di inclusione molto duro, la plastica consente di ottenere sezioni sottili dello spessore di poche centinaia di nanometri che possono essere osservate al microscopio elettronico.

Nel caso di organi i cui componenti abbiano consistenza disomogenea, come il nevrasse e l’osso, si preferisce l’inclusione in celloidina o in resina. Solo nel caso di tessuti calcificati all’inclusione viene fatta precedere la decalcificazione, per la quale si ricorre all’uso di acidi diluiti ovvero di chelanti, come l’acido tetracetico dell’etilendiamina (EDTA). Vi sono poi eventualità nelle quali non è possibile l’uso dell’inclusione, per esempio quella in cui si vogliano studiare i grassi neutri, i quali sono solubili in alcool ed in xilolo. Si ricorre in tal caso all’uso del microtomo congelatore. Con questo strumento si conferisce al pezzo la durezza necessaria per essere sezionato a mezzo del congelamento estemporaneo con neve carbonica.

Trova anche largo impiego il criostato che consta di una camera termicamente isolata entro la quale è collocato il microtomo. La temperatura della camera è mantenuta tra i -15 ed i -30 °C.

Colorazione dei Tessuti

La colorazione viene praticata principalmente per mettere in risalto singoli componenti strutturali. In altri casi viene eseguita al fine di identificare costituenti chimici particolari del tessuto. Se il tessuto da esaminare consiste in un monostrato di cellule (per esempio cellule coltivate in vitro, preparati per striscio di sangue circolante o preparati per schiacciamento), esso viene di solito osservato direttamente al microscopio. Negli altri casi, invece, si procede con la colorazione.

I coloranti sono di due tipi: naturali e sintetici. I primi possono essere di origine tanto animale che vegetale. I secondi, prodotti in laboratorio, sono derivati dall’anilina. I coloranti, ancora, si distinguono in vitali e sopravitali.

Coloranti Vitali e Sopravitali

I coloranti vitali hanno la proprietà di essere assunti attivamente da alcune cellule viventi permettendo così la loro identificazione o lo studio di funzioni particolari. Esempi di coloranti vitali sono:

Alizarina, incorporata elettivamente nella sostanza fondamentale dell’osso in corso di calcificazione, colorandola di rosso.
Blu Triptan, litio carminio, blu pirrolo, che sono fagocitati dai macrofagi permettendo così la loro individuazione.
Verde Janus, che colora elettivamente i mitocondri in virtù delle proprietà ossido-riduttive di questi organuli.
Rosso neutro, che colora i granuli specifici dei leucociti (in rosa quelli dei granulociti neutrofili, in giallo quelli degli eosinofili e in rosso mattone quelli dei basofili).
Blu di metilene, che colora l’assone dei neuroni.

I coloranti sopravitali, invece, sono somministrati a cellule o a tessuti isolati dall’organismo.

Classificazione Chimica dei Coloranti

I coloranti si legano ai tessuti mediante legami chimici con le proteine, gli acidi nucleici, le glicoproteine e le lipoproteine. Da un punto di vista chimico, quindi, i coloranti sono classificati in due categorie: coloranti acidi, nei quali il gruppo cromoforo è acido (anionico) e coloranti basici, nei quali il gruppo cromoforo è basico (cationico).

I coloranti acidi più comuni sono: eosina, arancio G, verde luce.

I coloranti basici più comuni sono: blu di metilene, blu di toluidina, tionina, verde di metile, pironina, azzurro B, fucisina basica.

Affinità dei Tessuti per i Coloranti

I componenti dei tessuti che hanno affinità per i coloranti acidi sono detti acidofili; quelli che mostrano affinità per i coloranti basici sono detti basofili. Bisogna considerare, però, che l’acidofilia e la basofilia dei vari costituenti cellulari dipendono dal pH della soluzione colorante. Ai valori di pH comunemente impiegati per una determinata colorazione istologica (pH = 6), la cromatina del nucleo, l’ergastoplasma, le mucoproteine e i glicosaminoglicani assumono i coloranti basici, mentre gli eritrociti, i granuli dei granulociti eosinofili ed alcune parti del citoplasma legano coloranti acidi.

I coloranti sono di regola indiretti in quanto la loro fissazione al tessuto necessita l’impiego di mordenzatori, ossia degli ossidanti (acido fosfomolibdico, acido picrico, acido fosfowolframico, acido cromico, permanganato di potassio, ecc.) che fungono da mezzo intermediario di collegamento tra struttura tissutale e colorante, fra i quali non esiste una particolare affinità.

I metodi di colorazione prevedono spesso l’uso di più coloranti, ciascuno capace di mettere in evidenza un particolare componente strutturale. In tal senso i singoli coloranti possono essere applicati successivamente ovvero contemporaneamente sotto forma di miscele bilanciate.

Esempi di Colorazioni Speciali

Le colorazioni istochimiche speciali e l’esame immunoistochimico sono delle tecniche diagnostiche ancillari all’esame istopatologico, che possono essere richieste/suggerite per confermare la diagnosi o fornire informazioni aggiuntive rispetto a quanto osservabile con la sola valutazione istopatologica (con colorazione di routine Ematossilina ed Eosina).

Nella maggior parte dei casi si tratta di esami eseguibili sul campione già inviato in formalina e solo una piccola percentuale di colorazioni va eseguita su campione di tessuto non fissato in formalina e congelato. La colorazione istochimica semplicemente permetterà di “vedere meglio” l’agente eziologico se presente.

Immunoistochimica

L’esame immunoistochimico, come indica il nome stesso, prevede l’utilizzo di anticorpi attraverso i quali sarà possibile individuare specifiche molecole nella sezione di tessuto. L’esame immunoistochimico può essere eseguito per via diretta o indiretta, anche se attualmente la maggior parte dei kit e coloratori automatici, utilizzano una metodologia indiretta.

La metodica indiretta si avvale di un anticorpo definito “primario” che legherà un determinato antigene che si vuole identificare nella sezione di tessuto. Nella diagnostica di routine l’esame immunoistochimico viene principalmente utilizzato per una migliore caratterizzazione delle neoplasie la cui istogenesi non può essere totalmente definita con la sola valutazione istopatologica.

Mastocitoma e Colorazioni Metacromatiche

Mastocitoma: le colorazioni istochimiche Blu di Toluidina e GIEMSA spesso evidenziano i granuli dei mastociti (normali e neoplastici), che vengono definiti metacromatici. Queste colorazioni possono essere suggerite per confermare il sospetto di mastocitoma e migliorare la sensibilità nel ricercare e quantificare mastociti in un linfonodo.

Colorazioni di Routine

Sono colorazioni di semplice attuazione che vengono usate soprattutto per avere una rapida diagnosi del tessuto osservato. Esse danno una specifica e chiara risposta sulla topografia, sulla conservazione e sulle condizioni generali del preparato.

Ematossilina ed Eosina

È la colorazione sicuramente più usata nei vari laboratori di istopatologia. Il nucleo e i vari componenti acidi del citoplasma vengono colorati in blu-viola dall’emallume, un colorante vegetale basico di cui esistono diverse varianti (ad es. di Mayer o Carazzi).

Colorazione per il Tessuto Nervoso Centrale

È una colorazione per il sistema nervoso centrale e si usa su sezioni in paraffina di 10 µm di spessore. E’ relativamente semplice, mette in evidenza la zona tigroide del Nissle, caratteristica del citoplasma dei neuroni, colorandola con il blu-azzurro tipico del blu di toluidina.