Scopri le Fasi Fondamentali per un Perfetto Allestimento di un Preparato Istologico

L'istologia è la branca della medicina che si occupa dello studio dei tessuti. Un tessuto è un insieme di cellule che hanno la stessa morfologia, la medesima funzione e la stessa derivazione embriologica. Per poter condurre un'osservazione e un'analisi istologica, è necessario allestire un preparato istologico, un processo che permette di osservare il campione al microscopio.

La funzione principale del microscopio, sia esso ottico che elettronico, è quella di ingrandire particolari che ad occhio nudo risulterebbero invisibili. Ma come è possibile osservare un organismo o un oggetto al microscopio? In questo articolo, descriveremo le fasi fondamentali affinché un campione di nostro interesse possa essere esaminato al microscopio ottico.

Due Metodi di Osservazione in Microscopia Ottica

L’osservazione al microscopio ottico ha come fine l’esame morfologico di cellule e tessuti e può essere di due tipi:

Osservazione in vivo
Osservazione di campioni non vitali

Osservazione In Vivo

L’osservazione in vivo consente di osservare cellule vive, non trattate e segue gli eventi dinamici degli organismi, come, ad esempio, lo sviluppo embrionale o la mitosi. Si effettua generalmente su cellule isolate o piccoli organismi. Nell’allestire il campione, si utilizzano vetrini portaoggetti su cui si deposita una goccia d’acqua all’interno della quale si pone il campione, ricoperto, al termine, da un vetrino coprioggetto.

Molte volte si utilizzano anche particolari vetrini con una conca centrale dove si deposita la goccia d’acqua in cui verrà immerso il campione che, anche in questo caso, verrà ricoperto dal vetrino coprioggetto. Si viene a creare così la “camera umida”, che evita che il campione possa disidratarsi a causa dell’evaporazione del liquido in cui è contenuto.

L’esame a fresco ha un utilizzo limitato in quanto le cellule presentano una scarsa sopravvivenza, un eccessivo spessore e soprattutto un esiguo contrasto. Per ovviare alla totale trasparenza delle strutture cellulari del campione, possiamo utilizzare diverse tecniche fornite dalla fisica e dall’ottica, ad esempio diversi sistemi di illuminazione ed osservazione; in alternativa, si possono utilizzare coloranti vitali, che devono essere ben assorbiti e sopportati dalla cellula. Distinguiamo una colorazione intra vitam e sopravitale. Tra i coloranti vitali ricordiamo: Alizarina, Blu Tripano, Verde Janus, etc.

A causa di queste limitazioni, l’osservazione in vivo, teoricamente favorita, viene utilizzata per una sola osservazione o per rapide osservazioni successive.

Osservazione di Campioni Non Vitali

L’osservazione di campioni non vitali invece, consente al meglio lo studio della morfologia interna della cellula, si può effettuare su organismi completi, tessuti, organi, cellule isolate, etc. Questo tipo di osservazione è molto più utilizzata, in quanto i campioni vengono trattati in modo tale da evitare, in seguito all’uccisione, la decomposizione e preservare le loro caratteristiche. Il campione si conserva nel tempo consentendo un maggior numero di osservazioni.

I campioni trattati costituiscono il preparato istologico.

Fasi Fondamentali per Allestire un Preparato Istologico

Le fasi fondamentali per allestire un preparato istologico sono:

Prelievo
Fissazione
Inclusione
Sezionamento
Montaggio
Colorazione

Con le dovute differenze, le fasi elencate valgono anche per la microscopia elettronica.

1. Prelievo del Campione

Prima di effettuare il prelievo, un organismo viene sacrificato o anestetizzato. Nell'ambito della medicina, per poter condurre la sua osservazione e dunque la sua analisi, l'istologo necessita di una piccola porzione d'organo. Quest'ultima viene, tipicamente, escissa dalla figura professionale del chirurgo di una struttura pubblica o privata in corso di una seduta operatoria, con il quale l'istologo collabora.

In seguito, utilizzando lame affilatissime, si procede a prelevare campioni di determinati organi o tessuti da studiare. Questa fase deve avvenire molto rapidamente, in modo da evitare i traumi che sopraggiungono in seguito alla morte cellulare. Un organismo, molte volte, può essere esaminato in toto, ossia interamente, senza prelevare tessuti o cellule in particolare.

2. Fissazione

La fissazione è una delle fasi più importanti, in quanto tende a prevenire la decomposizione e mantiene inalterato il quadro strutturale dei tessuti. Le cellule di un campione tissutale escisso vanno immediatamente ed inesorabilmente incontro ad un processo di autodegradazione, dovuto principalmente all'interruzione del flusso di sangue e della diffusione di ossigeno, che le conduce rapidamente a morte.

In seguito al prelievo, le componenti tissutali che sono state asportate, perdono le loro iniziali proprietà chimiche e fisiche, ciò a causa dei microorganismi che attaccano il materiale biologico e della variazione di temperatura e di pH. Per questi motivi, è necessario fissare il campione bioptico, preferibilmente subito dopo il prelievo, cioè trattarlo in maniera fisica o chimica per interrompere i processi autolitici prima citati, per conservare la forma cellulare e per ottenere un'"istantanea" delle cellule senza che subentrino nuove modificazioni della loro struttura interna.

Attraverso la fissazione, si cerca di fissare le molecole di un tessuto allo stato chimico e nella posizione in cui si trovavano in vivo, inoltre, per evitare l’autolisi, si agisce sulle componenti proteiche inattivando degli enzimi. Più è rapida la fissazione, più la struttura cellulare viene conservata nella configurazione più simile a quella in vivo.

La fissazione favorisce l’osservazione e la colorazione, consente ai coloranti di penetrare nei tessuti e di fissarsi a particolari strutture. I fissativi utilizzati si distinguono in fissativi fisici e fissativi chimici. La fissazione fisica può avvenire per rapido riscaldamento, in cui il campione viene essiccato eliminando l’acqua e denaturando la componente proteica, oppure tramite congelamento. Il congelamento prevede due metodi: il metodo del congelamento-essiccamento e congelamento-sostituzione.

La così detta fissazione fisica è una metodica che prevede il rapido congelamento del campione tramite vapori di azoto liquido (quest'ultimo si trova ad una temperatura di circa -196 °C), previo trattamento del campione con un gel crioprotettore.

I fissativi chimici sono suddivisi in: fissativi coagulanti le proteine, come acido acetico o alcool etilico; fissativi non coagulanti le proteine, come la formalina e il tetrossido di osmio. La formalina (aldeide formica al 40%) è uno dei fissativi maggiormente utilizzato in microscopia ottica.

La fissazione chimica, invece, prevede l'uso di sostanze chimiche che, penetrando nel campione immerso al loro interno in maniera centripeta, inibiscono le proteine enzimatiche che partecipano ai processi di autodigestione, bloccandoli.

Si possono anche utilizzare miscele fissative costituite da acqua, sali e uno o più fissativi chimici. Tra le miscele ricordiamo il liquido di Bouin, Carnoy, Müller, Susa, etc. La formalina neutra tamponata al 10% rappresenta il fissativo per eccellenza poiché mantiene inalterata la morfologia cellulare e l’architettura dei tessuti, oltre a conservare in maniera soddisfacente l’antigenicità di cellule ed agenti eziologici, bloccando i fenomeni di autolisi.

La scelta del fissativo è molto importante e dipende dallo studio da effettuare. La formalina penetra nei tessuti ad una velocità di circa 1mm/h: per tale ragione, i campioni di grandi dimensioni necessitano una fissazione prolungata; inoltre è consigliabile eseguire delle incisioni parallele e non compete, che facilitino la penetrazione del fissativo.

Formalina: Avvertenze e Utilizzo

La formaldeide è una molecola gassosa a temperatura ambiente, dall’odore pungente ed altamente solubile in acqua: la soluzione così ottenuta prende il nome di formalina. Come già specificato, non è sufficiente diluire la formalina con acqua, soprattutto se non deionizzata. Se si volesse preparare la soluzione in casa sono necessari oltre alla formaldeide al 40%, acqua deionizzata, sodio fosfato monosodico e bisodico necessari per la conservazione del PH (7,2-7,3). Per questo è assolutamente consigliabile acquistare soluzioni di formalina al 10% neutra tamponata pronta all’uso.

Essendo inoltre molecola volatile, tende ad evaporare facilmente, compromettendo la sicurezza dell’operatore che la sta preparando, trattandosi di un agente chimico pericoloso (irritante, caustico e cangerogeno, vedi linee guida del Ministero della Salute, CSS del 5/2015). Ad oggi non è ancora disponibile una valida alternativa alla formalina come fissativo dei campioni istologici: questa risulta quindi ancora indispensabile nei laboratori di anatomia patologica. Quello su cui si può intervenire è la riduzione dell’esposizione del personale a tale sostanza, mediante l’uso di contenitori pre-riempiti che annullano quasi totalmente l’esposizione diretta, l’utilizzo di cappe aspiranti nei laboratori di patologia e l’utilizzo di dispositivi di sicurezza individuali (es.

Per la fissazione e la conservazione dei campioni, è necessario utilizzare quindi contenitori a bocca larga e capienti: si ricordi che dopo l’immersione in formalina il campione, fissandosi, tenderà ad irrigidirsi. L’utilizzo di contenitori dalla bocca stretta provocherebbe problemi durante la fase di estrazione del campione dal contenitore.

3. Disidratazione e Diafanizzazione

Terminata la fissazione, il campione deve essere disidratato, cioè tutta l'acqua contenute nelle sue cellule deve essere allontanata perchè solo così si potrà procedere alla fase dell'inclusione. La disidratazione del campione istologico si ottiene immergendo quest'ultimo in soluzioni idroalcoliche a concentrazioni crescenti, tipicamente secondo questa scala: acqua distillata - alcol 70% - alcol 95% - alcol 100%.

Dopo che tutta l'acqua delle cellule è stata sostituita con l'alcol 100%, è necessario diafanizzare il campione, cioè immergerlo in una sostanza chimica che ha la caratteristica di essere miscibile sia con gli alcoli che con le molecole usate per l'inclusione (quindi, il diafanizzante rappresenta un prodotto di transizione che permette di preparare il campione alle fasi successive) e che ha l'obiettivo di rendere trasparente il campione così che potrà essere attraversato con più facilità dal fascio luminoso del microscopio.

Il tipico diafanizzante usato in Istologia è lo xilene, ormai sostituito da suoi analoghi perchè meno tossici. Come già specificato, l'uso dell'alcool asporta i lipidi presenti nel campione: caratteristico sarà così l'aspetto delle cellule adipose (per esempio), che appariranno come sferule vuote, perfettamente trasparenti.

4. Inclusione

I tessuti biologici prelevati hanno perso la loro consistenza, quindi devono essere inclusi all’interno di materiali più resistenti, in modo tale da acquisire una maggiore rigidità, ideale per il successivo sezionamento. Avendo rimosso tutta l'acqua dalle cellule del campione e avendola sostituta totalmente con il diafanizzante, è possibile procedere alla fase dell'inclusione, il cui scopo è quello di indurire il campione (spesso, infatti, si tratta di campioni di tessuto molle) e soprattutto di includerlo all'interno di un supporto/mezzo rigido che potrà essere, poi, tagliato per ottenere delle sezioni estremamente sottili.

L’inclusione non è necessaria se è avvenuta la fissazione fisica. Per effettuare l’inclusione possono essere usate diverse sostanze, per la microscopia ottica si utilizza generalmente paraffina. La paraffina è una cera a base di idrocarburi alifatici, in particolare alcani, che può impregnare il campione immerso al suo interno in maniera centripeta allontanando il diafanizzante e prendendo il suo posto. L’inclusione consiste nel lasciar permeare il tessuto da una sostanza che solidifica a temperatura ambiente atta a consentire il taglio in sezioni sottili dello spessore di pochi micron. Essa è correntemente rappresentata dalla paraffina.

La paraffina è una miscela di idrocarburi alifatici ed è apolare, ossia non miscibile con l’acqua, quindi prima dell’inclusione è necessaria una disidratazione. Reso il campione apolare, esso è posto in paraffina fusa, il tutto viene poi colato in stampi metallici e fatto raffreddare a temperatura ambiente.

La paraffina è una sostanza apolare, motivo per il quale non avrebbe potuto penetrare nel campione se le cellule di quest'ultimo avessero contenuto ancora acqua, la quale invece è polare. Alla fine del processo, ne risulterà un cubetto bianco di paraffina solida e dura, al centro del quale è "bloccato"/"incastrato" il campione. Si è ottenuto così un blocchetto rigido contenente il campione e pronto per essere sezionato.

5. Sezionamento

Il blocchetto di paraffina ottenuto deve essere sezionato ricavando fette estremamente sottili, circa 5-7 µm , in modo tale che la luce possa attraversarle e, dopo la colorazione, siano ben visibili al microscopio. Prima del sezionamento, con un bisturi o una lametta, il blocchetto deve essere sagomato, si elimina la paraffina in eccesso e si riduce così il suo spessore.

In microscopia ottica, la fase del taglio prevede l'utilizzo di uno strumento di laboratorio chiamato microtomo, più comunemente della sua variante rotativa (microtomo rotativo). Si tratta di uno strumento sul cui modulo portacampione viene montato il cubo di paraffina orientato secondo quanto necessario e nel cui modulo portalama viene inserita una lama molto simile ad un rasoio manuale.

Lo strumento usato in questa fase è il microtomo. Generalmente, in microscopia ottica, si utilizza il microtomo rotativo, costituito da un braccio, sul quale si monta il blocchetto di paraffina, una lama (generalmente d’acciaio) e una manovella. È proprio il movimento della manovella che avvicina il braccio alla lama di una distanza pari allo spessore delle sezioni desiderato.

Girando la manopola dello strumento, il modulo portacampione comincia a mouversi in verticale, dall'alto in basso e viceversa, e in avanti, avvicinando progressivamente la faccia del cubetto di paraffina alla lama di una distanza impostata dall'operatore. Tale distanza corrispondere allo spessore delle sezioni di campione che si vogliono ottenere: lo spessore ideale in microscopia ottica è di 5-7 micrometri.

Le varie sezioni che via via si ottengono dal taglio al microtomo corrispondono ad un'intera faccia del cubo di paraffina, dunque la porzione periferica di tali sezioni sarà sola paraffina che non contiene materiale utile (il campione, infatti, si trova posto centralmente). Le sezioni vengono, così, portate delicatamente sulla superficie dell'acqua posta all'interno di un bagnetto riscaldato a 37 °C (bagno stendifette): tale operazione ha lo scopo di favorire la distensione delle sezioni e di ammorbidire la paraffina, nonchè di poterle raccogliere su vetrino.

Infatti, una volta che le sezioni sono ben distese sulla superficie dell'acqua, vengono raccolte con il vetrino porta-oggetti facendole aderire all'estermità del vetrino stesso. Tale adesione è spontanea e non richiede particolari accorgimenti. Quella appena descrittà è la così detta "tecnica delle fette".

6. Montaggio

Le sezioni ottenute vengono poi montate sul vetrino portaoggetti, sul quale devono essere incise le informazioni riguardanti il campione. Prima dell’adesione i vetrini devono essere opportunamente sgrassati. Esistono diverse sostanze adesive da porre sul vetrino per consentire il montaggio delle sezioni, solitamente si utilizza albumina glicerinata.

L’albumina glicerinata si prepara a partire da albume d’uovo e glicerina, con aggiunta di sostanze antimuffa. Al momento dell’utilizzo, alla soluzione di albumina glicerinata, si aggiunge dell’acqua distillata. Si procede ponendo il vetrino su una piastra riscaldata e su di esso, con una pipetta, si pone la soluzione adesiva. Attraverso l’ausilio di un pennello, le sezioni sono poste sulla soluzione adesiva, la quale, essendosi riscaldata, consente la dilatazione della paraffina, di conseguenza la distensione dei tessuti. I vetrini rimangono sulla piastra riscaldata in modo tale da far evaporare la maggior parte della soluzione, in seguito sono posti in stufa per 24 ore a 37 °C per farli essiccare.

7. Sparaffinatura e Idratazione

Le fasi di sparaffinatura ed idratazione sono fondamentali per poter concludere la preparazione del campione istologico e corrispondono semplicemente al rovescio delle fasi di disidratazione e diafanizzazione viste in precedenza: in tal caso, è necessario immergere le sezioni prima nel diafanizzante (xilene od analoghi) per sparaffinare e, poi, nella serie di soluzioni idroalcoliche a concentrazioni decrescenti (alcol 100% - alcol, 95% - alcol 70%), fino all'acqua distillata, per reidratare il campione.

La sparaffinatura è importante per rimuovere la paraffina periferica dalle sezioni che erano state raccolte su vetrino e per allontanare la paraffina che aveva impregnato le sezioni. Tale allontanamento permette, a sua volta, di far penetrare nelle cellule gli alcoli e far sostituire questi con sola acqua durante la reidratazione. In questo caso, la reidratazione ha l'obiettivo di permettere la fase successiva, cioè quella della colorazione, poichè la maggior parte dei coloranti utilizzati in istologia sono coloranti acquosi (non penetrerebbero nelle cellule se in queste vi rimanesse paraffina).

8. Colorazione

La colorazione è la fase propedeutica all’osservazione microscopica, in quanto aumenta il contrasto delle diverse componenti cellulari e tissutali e ne migliora la leggibilità. Le cellule sono naturalmente trasparenti dato che sono costituite essenzialmente da acqua, motivo per il quale per poterle osservare al microscopio devono essere colorate artificialmente per generare un contrasto tra le loro diverse componenti.

Come già affermato, i coloranti si usano in soluzione e, affinché penetrino nei tessuti, quest’ultimi devono essere idrofili. Dato che il campione è incluso in paraffina, sostanza idrofoba, prima della colorazione, è necessaria una fase di sparaffinatura ed idratazione. I vetrini sostano per alcuni minuti in xilene, in seguito in etanolo a concentrazione sempre minore ed infine in acqua distillata. Si può procedere così all’esecuzione della colorazione, al termine della quale i vetrini devono essere chiusi e conservati.

Tipi di Colorazione

Colorazioni fisiche: Si basano sull'impiego di coloranti che si sciolgono in determinate strutture del campione senza instaurare legami chimici con quest'ultime.
Colorazioni chimiche: Si basano sull'impiego di coloranti che o instaurano legami chimici con le strutture del preparato, soprattutto in base alle loro proprietà ed affinità acido-base, o che per reazione danno un prodotto di nuova sintesi colorato e sarà quest'ultimo a legarsi alle strutture del preparato. Le colorazioni chimiche vengono ulteriormente distinte in base al numero di coloranti che bisogna utilizzare, dunque si avranno colorazioni bicromiche con due coloranti, tricromiche con tre coloranti ecc...

I coloranti sono molecole organiche aromatiche e ionizzabili, si usano generalmente in soluzione (importante è la scelta del solvente, generalmente si usano quelli polari) e li classifichiamo in:

Sintetici
Naturali
Acidi
Basici

I coloranti acidi (ricordiamo l’Eosina) si legano a molecole con caratteristiche basiche, come le proteine citoplasmatiche, mentre i coloranti basici (ricordiamo l’Emallume acido di Mayer) si legano a molecole con caratteristiche acide, come il DNA. In genere questi coloranti vengono combinati tra loro per far risaltare al meglio le diverse componenti cellulari e tissutali. Un esempio è la colorazione Ematossilina e Eosina in cui si combina l’azione dell’Emallume acido di Mayer e dell’Eosina.

Esistono, inoltre, tecniche di colorazione diverse: Istologica, Istochimica, Immunoistochimica ed in Immunofluorescenza. Una tra le più comuni tecniche di colorazione utilizzata in anatomia è quella che prevede l'utilizzo di ematossilina e di eosina, due coloranti che hanno caratteristiche opposte. L'ematossilina è un colorante basico, che colora tutte le strutture acide della cellula in viola-blu, come il nucleo che contiene il DNA e l'RNA immerso nel citoplasma, qualora le celluleOsservate sono coinvolte in un'intensa attività di sintesi proteica (assumono per questo motivo il nome di cellule basofile).

Se il colorante reagisce con un solo tipo di struttura allora la colorazione sarà ortocromatica, se invece un colorante reagisce con più tipi di strutture virando il proprio colore allora si parla di colorazione metacromatica. A tal riguardo infatti, è necessario ricordare che alcuni coloranti basici, quando interagiscono con particolari strutture nei tessuti, cambiano il loro colore normale da blu a rosso o porpora.

Esempio: colorazione col blu di toluidina, che in soluzione è blu-violetto, mentre quando entra in contatto con particolari strutture le colorerà in porpora/rosso. La metacromasia è dovuta alla presenza all'interno dei tessuti di polianioni, che causano l'aggregazione delle molecole di colorante, le quali, organizzate così in dimeri o polimeri, modificano le proprie.

Ancora una volta si rende necessario disidratare il campione immergendo le sezioni in soluzioni alcoliche a concentrazioni crescenti, fino al diafanizzante (acqua distillata - alcol 70% - alcol 95% - alcol 100% - xilene o analoghi).

9. Montaggio Finale (Chiusura Vetrini)

La chiusura avviene utilizzando sostanze non miscibili con l’acqua, ma con lo xilene, quali resine sintetiche, ma soprattutto il Balsamo del Canada, resina vegetale. Si eseguiranno i passaggi contrari alla precedente idratazione, i vetrini verranno posti in etanolo a concentrazione sempre maggiore ed infine in xilene.

L'ultima fase della preparazione del campione istologico è rappresentata dal così detto montaggio, operazione che consiste nel far colare una goccia di balsamo di montaggio (balsamo del Canadà o analoghi) in corrispondenza della sezione raccolta sul vetrino porta-oggetti ed adagiare delicatamente sullo stesso punto il vetrino copri-oggetto (vetrino più sottile e piccolo). Solo al termine di tutte queste fasi, si potrà procedere all'osservazione e allo studio del proprio campione.

Al termine della colorazione si effettua il montaggio che consente di conservare a lungo il preparato per eventuali future osservazioni: sulla fettina asciutta viene posta una goccia di un mezzo di montaggio (solitamente balsamo del Canada, che è una resina adesiva) e su questa un sottilissimo vetrino copri-oggetto. Con la solidificazione del mezzo, il preparato istologico, ora permanente, è pronto per l'osservazione al microscopio.

Osservazione al Microscopio

Le sezioni dovranno essere analizzate mediante strumenti specifici che sono i microscopi, i più comuni nei laboratori istologici sono i microscopi ottici di cui naturalmente abbiamo diverse tipologie. Infatti, oltre al microscopio ottico tradizionale in campo chiaro, esistono anche altri tipi di microscopio ottico, come il microscopio a contrasto di fase, il microscopio a contrasto di interferenza differenziale, il microscopio in campo scuro, il microscopio a fluorescenza, ecc.

Il primo momento dell'esame istologico consta nell'osservazione, a occhio nudo e contro luce, della sezione. l'uniformità della colorazione o la presenza di aree di diverso colore o intensità possono essere indicative della presenza di un tipo di tessuto piuttosto che di un altro. Macchie di colore bluastro potrebbero far pensare ad addensamenti di tessuto linfoide; zone colorate scarsamente o trasparenti, alla presenza di tessuto adiposo, e così via.

Il secondo momento dell'esame istologico è riservato all'osservazione microscopica: sistemato il vetrino sul tavolino porta-preparati, ed effettuate le opportune regolazioni dello strumento, si esamina l'intera sezione con un obiettivo a piccolo ingrandimento (per esempio 10x). Con ciò si ha un'idea generale del preparato, e inoltre si può individuare laporzione più favorevole per l'esame a ingrandimenti maggiori. L'esame a piccolo ingrandimento rivela se il campione è formato da tessuti diversi, quali sono i loro rapporti reciproci, le eventuali differenze più manifeste.