Scopri Tutto sul TCR Esame del Sangue: Significato, Tipologie e Come Interpretare la Diagnosi

La tipizzazione linfocitaria è un'analisi fondamentale per l'accertamento e la diagnosi delle malattie ematologiche, ossia che colpiscono il sangue, così come di diverse patologie che interessano il sistema immunitario. I linfociti sono cellule che, tipicamente, vanno a costituire all'incirca il 25% della quantità totale dei globuli bianchi (chiamati anche leucociti) presenti nell'organismo umano.

Tipologie di Linfociti

Esistono due tipologie principali di linfociti:

Linfociti B: Cellule del sistema immunitario umorale che riconoscono gli antigeni, producendo anticorpi per contrastarli. Sono le uniche cellule capaci di generare anticorpi, in grado di riconoscere molecole come carboidrati, proteine e lipidi. Le proteine degli anticorpi si trovano sulla membrana del linfocita e fungono da recettore per gli antigeni senza necessità di presentazione degli stessi sulla cellula infetta.
Linfociti T: Cellule del sistema immunitario cellulo-mediato che secernono le citochine. Vengono prodotte nel midollo osseo per poi migrare e completare la loro maturazione in altri tessuti.
- Linfociti T helper (CD4)
- Linfociti T citotossici (CD8): cellule chiamate così a causa della loro azione distruttiva (“killer”) nei confronti di cellule infette, specialmente virus, e di cellule disfunzionali come quelle tumorali. Le cellule Natural Killer rilasciano citochine e chemochine in grado di causare la lisi delle cellule infette.

Come Avviene l'Esame di Tipizzazione Linfocitaria?

Si tratta di un'analisi semplice, rapida e non invasiva per il paziente. Il sangue prelevato viene custodito in una provetta e successivamente analizzato con diversi metodi: la citometria a flusso, l’immunofluorescenza e varie tecniche immunoenzimatiche.

Biomolecular Diagnostic mette a disposizione un’analisi di tipizzazione linfocitaria per approfondire le funzionalità del sistema immunitario e per l’impostazione corretta dei protocolli di Micro Immuno Terapia.

Analisi del Sangue Periferico

Nella maggior parte dei casi, il primo approccio alla diagnosi del paziente è rappresentato dall’analisi del sangue periferico che viene oggi effettuato da analizzatori ematologici dedicati di ultima generazione i quali, a prescindere dalla tecnologia utilizzata, in meno di un minuto forniscono in completa automazione un referto emocromocitometrico completo di formula leucocitaria. L’evoluzione delle tecniche automatiche di analisi delle cellule del sangue, iniziata da meno di mezzo secolo, è stata continuativa ed ha trasformato in maniera radicale la realtà operativa del laboratorio di ematologia.

Le tecnologia originali sviluppate per il conteggio cellulare sono state perfezionate per ottenere la misurazione sia delle dimensioni delle cellule, con parametri medi e istogrammi di distribuzione, che di altre diverse proprietà chimiche e fisiche, che ne permettono la classificazione in popolazioni distinte. L’esame emocromocitometrico si è trasformato in un profilo ematologico completo, comprendente misurazioni quantitative dirette e indici da esse derivati, che informano sulle proprietà dei globuli rossi, delle piastrine e dei leucociti.

Quando i parametri del referto emocromocitometrico rientrano nei valori di normalità per età, sesso e razza, in assenza di una specifica richiesta clinica, l’esame viene validato senza eseguire ulteriori approfondimenti diagnostici. In presenza di alterazioni di tipo quantitativo e/o qualitativo dell’esame emocromocitometrico e/o in presenza di allarmi strumentali, è necessario allestire uno striscio di sangue periferico, colorato con colorazioni panottiche ed esaminato al microscopio ottico.

L’allestimento, la colorazione e l’osservazione al microscopio di uno striscio di sangue periferico devono essere effettuati secondo regole e standard presenti nelle linee guida internazionali. L’osservazione al microscopio di uno striscio di sangue deve seguire un percorso sistematico, che comincia con l’ispezione di tutto il preparato con un obiettivo a bassa risoluzione (x10) per valutare nello striscio sia gli aspetti di qualità della distribuzione delle cellule, come la eventuale presenza di aggregati piastrinici, leucocitari o leuco-piastrinici, di agglutinati eritrocitari, di rouleaux.

Si prosegue poi ad esaminare lo striscio con un obiettivo ad alta risoluzione (x50 o x100) sia per valutare dettagli morfologici di tutte le linee cellulari che per eseguire una conta differenziale.

Il riscontro di alterazioni morfologiche prevalenti nella serie eritroide rappresenta spesso il primo passo di uno percorso diagnostico mirato: la presenza di parassiti intracellulari per la diagnosi di malaria, il riscontro di schistociti per la diagnosi di Microangiopatia trombotica, di sferociti o ellissociti per la diagnosi di anemie emolitiche congenite, di falci per la diagnosi di anemia falciforme, di dacriociti espressione di eritropoiesi in midollo con fibrosi ovvero di eritropoiesi extramidollare, rappresentano solo alcuni esempi di caratteristiche morfologiche che rimandano a specifiche diagnosi.

Anche le alterazioni morfologiche delle piastrine devono essere accuratamente esaminate: in presenza di un conteggio basso di piastrine, deve essere categoricamente esclusa la presenza sullo striscio di aggregati piastrinici causa di falsa piastrinopenia (pseudopiastrinopenia); in presenza di piastrinopenia vera con piastrine giganti devono essere ricercate le inclusioni leucocitarie che, se presenti, fanno orientare la diagnosi verso forme familiari congenite.

Negli esami di routine la formula leucocitaria si esegue su 100 cellule nucleate, mentre in un contesto di diagnostica onco-ematologica la conta differenziale sul sangue periferico deve essere eseguita su 200 elementi.

Le alterazioni quantitative dei leucociti, usualmente fornite dal referto generato in automazione dagli analizzatori cellulari, possono interessare una o più linee cellulari e possono manifestarsi come valori in eccesso (citosi) e/o in difetto (citopenie). Le alterazioni qualitative, quasi sempre suggerite sotto forma di allarme dagli analizzatori, devono essere attentamente ricercate al microscopio ottico in tutte le linee cellulari.

In presenza di blasti è sempre necessario eseguire una colorazione citochimica per la mieloperossidasi per confermare l’appartenenza alla linea granulocitica; blasti otticamente negativi alla mieloperossidasi possono comunque risultare appartenenti alla linea granulocita quando vengono analizzati con la determinazione dell’immunofenotipo. L’esecuzione della citochimica per le esterasi non specifiche è fondamentale per identificare blasti appartenenti alla linea monocitica. La colorazione con il Blu di Toluidina identifica le granulazioni basofile, grazie alle loro caratteristiche metacromatiche.

Valori di Riferimento dei Linfociti

Il valore ematico di riferimento dei linfociti varia in base al laboratorio analisi che analizza il campione; in riferimento al laboratorio unico di Area Vasta Romagna, l’intervallo di riferimento risulta essere: linfociti: 1.00 - 4.00 * 10^9 /L.

Il riscontro di linfocitosi (aumento dei linfociti) può essere conseguente a diverse condizioni cliniche come ad esempio: infezioni batteriche o virali, epatiti, leucemie linfocitiche.

I linfociti sono cellule prodotte dal sistema tessutale linfoide, sono uno dei tre elementi della serie bianca del sangue e tramite i propri recettori di membrana mediano la risposta immunitaria proteggendo l’organismo da minacce di batteri, virus, parassiti, funghi.

Test di Clonalità Linfoide (PARR)

Non sono rari i casi in cui l’esame citologico non è in grado di fornire un grado adeguato di certezza, come in caso di estrema fragilità cellulare, ad esempio per l’effetto citolitico dei corticosteroidi prima del prelievo del campione. In questi casi si possono utilizzare i preparati citopatologici dai quali si sospetta la proliferazione linfomatosa e richiedere un test di clonalità linfoide.

Il test di clonalità linfoide o PARR (PCR for Antigen Receptor Rearrangement) sfrutta la tecnica PCR per amplificare regioni del DNA che codificano per la porzione legante l’antigene della catena leggera delle immunoglobuline o del TCR (T-Cell Receptor) dei linfociti. Il riarrangiamento delle sequenze di queste regioni porterà le stesse ad essere differenti per lunghezza e sequenza di basi conferendo a ciascun linfocita, T o B, una caratteristica specificità antigenica. Di conseguenza, il test PARR per un campione di tessuto linfoide normale o reattivo fornirà come risultato una varietà di prodotti di amplificazione (policlonalità).

Esistono due fenotipi, T o B. Il fenotipo è un fattore prognostico rilevante, considerando che, generalmente e con alcune eccezioni, i linfomi T si associano a una minore percentuale di risposta, ad una minore persistenza della remissione e alla sopravvivenza.

Sebbene il riarrangiamento genetico dei linfociti sia solitamente associato alla linea cellulare B o T, linfociti B possono avere riarrangiamento dei loci dei linfociti T e, viceversa, linfociti T possono avere riarrangiamento dei loci dei linfociti B; questo fenomeno è detto riarrangiamento cross-lineage. Inoltre, anche le cellule mieloidi possono riarrangiare loci dei linfociti B o T.

La clonalità linfoide si può eseguire anche dopo una diagnosi dubbia di linfoma, ottenuta in ambito istopatologico. Prima di procedere vi consigliamo prima di contattare il Servizio di Istopatologia, per ricevere i consigli piu’ adeguati alla gestione del vostro caso.

Monitoraggio della Chemioterapia e Malattia Minima Residua (MMR)

La ricerca della malattia minima residua (MMR) è una delle applicazioni più interessanti ed innovative della genetica in ambito oncologico. In particolare, nel caso del linfoma è possibile individuare nel sangue periferico la ricomparsa del clone neoplastico prima della recidiva clinica (ad esempio prima della ricomparsa di linfoadenomegalia). L’iter prevede come primo step l’analisi di clonalità “tradizionale” con primer per regioni consenso, al momento della diagnosi. Quindi, se si identifica il riarrangiamento clonale si procede con il sequenziamento e il disegno di primer definiti paziente-specifici che amplificano solo il clone in questione.

Se si vuole utilizzare la genetica per la valutazione della MMR è necessario richiedere il sequenziamento e il disegno dei primer pazienti-specifici su campioni ottenuti prima di iniziare la chemioterapia. In corso di monitoraggio si eseguirà la ricerca del solo clone, individuato e conservato nella banca dati. Si dovrà informare il Laboratorio che si sta eseguendo un monitoraggio di un paziente precedentemente già studiato.

Al pari di qualsiasi altra indagine diagnostica, non possiamo attribuire una sensibilità e specificita’ del 100% alle prove di clonalità linfoide. Inoltre, essendo una tecnica di recente scoperta esiste senz’altro un margine di miglioramento e ottimizzazione. Possibili cause di errore includono:

Utilizzo del gene per la catena gamma del recettore dei linfociti T (TCRG), che presentano minore diversità giunzionale.
Fenomeni di pseudoclonalità. Solitamente si osservano in caso di DNA di scarsa qualità o di DNA con un template limitato.
Infezioni croniche.

Immunoterapia Cellulare Adottiva

L’immunoterapia cellulare adottiva si è dimostrata efficace in pazienti con alcuni tipi di tumore, anche in stadio avanzato. Questo approccio si basa sul presupposto che il sistema immunitario è un’arma molto potente e può essere utilizzato nella terapia dei tumori. Negli ultimi decenni, infatti, sono stati condotti studi clinici sperimentali basati sulla somministrazione a pazienti con tumori di cellule del sistema immunitario, chiamati linfociti T, alcuni dei quali sono in grado di riconoscere ed eliminare le cellule tumorali.

Ogni linfocita T è specifico per un determinato antigene (piccolo frammento di una proteina). Ciò significa che nel nostro organismo ci sono tanti linfociti T diversi, che riconoscono antigeni diversi come antigeni virali o fungini. Essi, grazie alla loro specificità di riconoscimento, ci difendono da molte malattie, eliminando, ad esempio, virus e funghi. Cosa conferisce la specificità? Il “recettore dei linfociti T” (TCR), ovvero una molecola presente sulla superficie del linfocita T composta da due catene legate tra loro. Ogni linfocita esprime un solo tipo di TCR, diverso da quello degli altri linfociti T presenti nello stesso individuo. I linfociti che riconoscono antigeni tumorali possono attaccare le cellule tumorali. Purtroppo sono molto rari e spesso non bastano per eliminare il tumore.

TCR Gene Editing

TCR gene Editing è “l’evoluzione” di TCR Gene Transfer, una procedura che permette di generare rapidamente un numero elevato di linfociti T specifici per un determinato tumore. I linfociti anti-tumorali sono generati in laboratorio tramite il trasferimento genico, nei linfociti T di un paziente, dei geni di un TCR anti-tumorale, preventivamente isolato in laboratorio dai rari linfociti anti-tumorali.

Questi linfociti tumore-specifici prodotti in laboratorio, tuttavia, differiscono da quelli naturali poichè presentano due diversi tipi di TCR, quello endogeno (presente già prima del trasferimento genico) e quello esogeno, anti-tumorale che è stato introdotto tramite la manipolazione genetica. La presenza di 2 TCR diversi sulla stessa cellula comporta sia problemi di efficacia che di sicurezza.

Il TCR anti-tumorale deve infatti competere con quello endogeno per accedere alla membrana cellulare e dunque per poter riconoscere il tumore. I linfociti generati con questa tecnologia sono dunque meno efficaci rispetto ai rari linfociti anti-tumorali che originano naturalmente. Inoltre, poiché ogni TCR è formato da due catene, i linfociti prodotti tramite TCR-gene transfer esprimono quattro diverse catene che possono appaiarsi in modo scorretto formando nuovi TCR con specificità imprevedibili che possono riconoscere e danneggiare tessuti sani del paziente, provocando reazioni di autoimmunità.

I ricercatori del San Raffaele, hanno superato i limiti di TCR Gene Transfer e messo a punto “TCR-gene editing” una procedura attraverso la quale è possibile, sostituire il TCR endogeno con il TCR anti-tumorale, generando un numero elevato di linfociti che esprimono alti livelli del solo TCR anti-tumorale. Questa tecnologia consente dunque di produrre, potenzialmente per ogni paziente, linfociti T efficaci e sicuri quanto i linfociti T anti-tumorali naturali.

Ciò è stato possibile grazie all’utilizzo di Zinc Finger Nucleases (ZFN), molecole artificiali in grado di riconoscere sequenze specifiche di DNA (scelte a priori dagli scienziati) e di provocare tagli nella sua doppia elica. Questo taglio nel DNA provocato dalle ZFN interrompe l’informazione genetica e rende la cellula incapace di produrre la proteina codificata dal gene colpito dalle ZFN. L’editing del DNA con le ZFN e’ stato applicato alla terapia genica per la prima volta dal gruppo di Luigi Naldini ed e’ stato riconosciuto come “metodo dell’anno” alla fine del 2011 dalla rivista Nature.