L’esame standard del liquido seminale, detto spermiogramma, è l’esame di base nella valutazione clinica della coppia infertile e rappresenta il punto di partenza per un eventuale trattamento con tecniche di PMA. I parametri che determinano la qualità del seme forniscono informazioni sulla produzione di spermatozoi da parte dei testicoli, sulla pervietà e sulla funzionalità dell’apparato riproduttore maschile, sull’attività delle ghiandole accessorie e sulla capacità di eiaculare. Benchè l’analisi dello sperma non permetta una distinzione clinica tra pazienti fertili ed infertili, tuttavia, quando diminuisce la qualità del liquido seminale, diminuiscono in senso statistico le probabilità di concepimento.
Per una corretta esecuzione laboratoristica dell’esame è fondamentale la standardizzazione dell’analisi: da alcuni anni viene considerato come linea guida il manual WHO (WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 2010). La necessità di delimitare sempre più le caratteristiche seminali, sia del maschio fertile che infertile, ha portato alla pubblicazione delle successive edizioni del “Manuale per l’esame e il trattamento del seme umano”, pubblicato dall’Organizzazione mondiale della salute (OMS): quella del 2010 (5a ed.) è in vigore.
Raccolta del Campione Seminale
La raccolta ideale deve essere eseguita dopo un periodo di astinenza da qualsiasi pratica sessuale di minimo 2 e massimo 7 giorni (WHO 2010). La raccolta tramite coito interrotto non è una modalità idonea in quanto si può verificare la perdita della prima frazione dell’eiaculato, che di solito contiene la più alta concentrazione di spermatozoi e può comportare una contaminazione del liquido seminale con secrezioni vaginali che possono interferire sulla motilità degli spermatozoi.
Inoltre, un’astinenza troppo prolungata provoca accumulo di spermatozoi con possibile riduzione della motilità e alterazione della morfologia, mentre un’astinenza troppo breve o eiaculazioni frequenti nel periodo precedente la raccolta possono causare la riduzione del volume dell’eiaculato e del numero degli spermatozoi. Rispettare il periodo di astinenza sessuale permette di paragonare i dati seminali a valori standard di normalità.
Essendo il campione molto sensibile a sbalzi di temperatura, è importante una volta compiuta la raccolta evitare escursioni termiche durante il trasporto del campione in laboratorio. La modalità migliore di raccolta è direttamente nei locali del laboratorio che analizzerà l’esame, ma puo’ essere raccolto anche in altri luoghi (ad es casa propria) purche’ si trasporti entro 40 minuti al laboratorio prescelto in un barattolino da urinocoltura sterile senza sbalzi di temperatura ( temperatura ideale 37°) ad esempio mettendolo dentro la giacca o sotto il maglione a contatto con il calore corporeo.
Condizioni febbrili di origine virale o batterica, terapie con farmaci, l’assunzione di anabolizzanti per uso “sportivo” e molti altri eventi patologici o terapeutici, possono interferire sulla qualità del campione seminale. Devono essere segnalati gli eventuali farmaci presi in precedenza o terapie farmacologiche croniche in atto. Si deve segnalare inoltre se si è avuto febbre elevata o altre patologie nei tre mesi precedenti all’esame e se si è perso parte del campione durante la raccolta.
Il liquido seminale essendo un liquido biologico puo’ subire variazioni in relazione agli eventi sopracitati, quindi sarebbe buona norma anche in caso di uno spermiogramma normale ripetere l’esame due volte a distanza di 3 mesi.
Parametri Macroscopici dell'Esame Seminale
La valutazione della qualità dell’eiaculato prevede l’analisi di diversi parametri, alcuni valutabili macroscopicamente e altri valutabili al microscopio. Ci sono molti parametri da tenere in considerazione in un seminogramma, che possono essere suddivisi in quelli che possono essere valutati ad occhio nudo (macroscopici) e quelli che no (microscopici). L’esame macroscopico prevede l’analisi di cinque parametri: aspetto, fluidificazione, viscosità, volume e pH.
Aspetto
Il liquido seminale presenta visivamente un aspetto opaco e di colore bianco-grigiastro. Il colore usuale dello sperma è bianco opalescente, leggermente giallastro. In un referto di uno spermiogramma sarà possibile leggere però anche altre diciture come lattescente, pioide, bruno (ematico). Un’eventuale trasparenza del campione indica generalmente riduzione della componente nemaspermica, mentre un aspetto di colore giallastro o rossastro indicano, rispettivamente, un’elevata concentrazione di leucociti o emazie spesso entrambi segno di flogosi o infezione delle vie seminali. Un campione seminale lattescente indica la presenza di una forte componente prostatica, tale aspetto è tipico nel caso di ostruzione delle vie genitali.
Fluidificazione
La fluidificazione del liquido seminale segue l’iniziale coagulazione. Appena emesso, lo sperma coagula per poi liquefarsi. La liquefazione si completa nel giro di 30 minuti a temperatura corporea (37 °C). Dopo l’eiaculazione, lo sperma presenta uno stato coagulato e ha bisogno di liquefare per procedere con il suo studio; un campione di sperma si liquefa completamente in circa 15-20 minuti a temperatura ambiente. Se dopo 60 minuti la fluidificazione non è completa, si parla di fluidificazione ritardata, quadro compatibile con disturbi prostatici. La misurazione viene effettuata facendo percolare il liquido lungo le pareti della provetta osservando la qualità del liquido contro una sorgente luminosa.
Viscosità
La misurazione della viscosità avviene facendo gocciolare il liquido da una pipetta, osservando come le gocce dovrebbero susseguirsi in maniera ritmica una dopo l’altra. Mentre la fluidificazione è un processo dinamico transitorio di dissolvimento di un coagulo, la viscosità è una caratteristica permanente di un determinato liquido seminale. Normalmente viene valutata facendo defluire lentamente il liquido seminale da una pipetta: un liquido seminale non viscoso forma un filo inferiore ai 2 cm. Una diminuzione della viscosità può associarsi a scarsa componente cellulare spermatica e non; mentre l’aumento della viscosità visibile con la formazione di filamenti può derivare da uno stato di flogosi o da una patologia prostatica o delle vescichette seminali e può causare difficoltà al movimento degli spermatozoi, tanto da non consentire il raggiungimento del canale cervicale. Si riferisce alla fluidità dell’intero campione, che può essere normale o elevata; i metodi per diminuirla sono gli stessi della liquefazione.
Volume
L’analisi del volume permette la valutazione della funzionalità delle ghiandole accessorie e della pervietà delle vie genitali. Il volume dell’eiaculato (in condizioni normali da 1,5 a 5 mL) è un marker della funzionalità delle vescichette seminali in quanto queste producono dal 50% all’80% della componente liquida dello sperma. Il volume normale di un eiaculato, dopo 3-5 giorni di astinenza sessuale, è compreso tra 1,5 e 6 ml. E’ considerato normale nell’intervallo compreso tra 2 e 5 ml; le alterazioni del volume del liquido seminale possono essere caratterizzate dalla completa assenza di liquido seminale o dalla riduzione o aumento della sua quantità.
La condizione di completa assenza di fluido seminale si indica con il termine di “aspermia”; questo fenomeno può essere conseguente ad eiaculazione retrograda o a mancata fase di emissione del liquido seminale in uretra. Con il termine di “ipoposia” si intende la condizione in cui si ha un volume inferiore ai 1,5 ml; tale alterazione può essere dovuta ad una ridotta astensione dai rapporti sessuali o eiaculazioni, ad una raccoltaseminale incompleta o a flogosi prostato-vescicolari. Infine, nel caso in cui si abbia un aumento di volume (sopra ai 6 ml) si parla di “iperposia” e tale condizione può essere dovuta ad astinenza prolungata o alla presenza di flogosi prostato-vescicolari. Un volume più basso è chiamato Ipospermia, mentre un volume più alto è chiamato Iperspermia.
pH
Il pH seminale è alcalino, con valori di normalità compresi tra 7,2 e 7,8. Il liquido seminale ha normalmente un pH alcalino, che oscilla tra 7,5 e 8,0, ed è la risultante tra la secrezione basica delle vescichette seminali e la secrezione acida della prostata. Valori superiori a 8 indicano generalmente patologie flogistiche mentre, variazioni nel senso opposto, con valori inferiori a 7, possono associarsi a patologie ostruttive dei dotti eiaculatori, a ipotrofie congenite o acquisite delle vescicole seminali. Il valore deve essere superiore a 7.1. Valori più bassi degli stessi e una bassa concentrazione di spermatozoi potrebbero indicare una disgenesia dei vasi efferenti, cioè un’ostruzione dei dotti eiaculatori.
Parametri Microscopici dell'Esame Seminale
La seconda parte dell’analisi consiste nella valutazione dei parametri microscopici; mentre all’esame microscopico vengono valutati: la concentrazione nemaspermatica, la motilità, la morfologia, eventuale presenza di agglutinazioni, la vitalità e la presenza di cellule non spermatiche.
Concentrazione Nemaspermatica
La determinazione della concentrazione spermatica, espressa in milioni di spermatozoi per millilitro di seme, e il conteggio spermatico totale, espresso in milioni di spermatozoi per eiaculato, sono parametri importanti per valutare gli aspetti quantitativi della spermatogenesi. Concentrazione degli spermatozoi indica il numero di spermatozoi presenti in 1 mL di eiaculato.
La determinazione della concentrazione spermatica può essere effettuata mediante l’utilizzo della camera di Neubauer e della camera di conta Makler, che è quella utilizzata nel nostro laboratorio. La valutazione viene effettuata con l’ausilio di camere di conta come: Fast Read, Neubauer modificata, Burker, Thoma; mentre quella consigliata è la camera di Makler. Per effettuare il conteggio si dispone una goccia di liquido seminale sul portaoggetti della camera e lo si copre con il vetrino coprioggetto. Si utilizza un microscopio a contrasto di fase e si determina il numero degli spermatozoi presenti in 10 quadrati del reticolo; questo numero rappresenta la concentrazione degli spermatozoi in milioni per millilitro.
Oggi la normospermia si ottiene con un numero di spermatozoi > 15×106 ml e un numero di spermatozoi totali > 39×106. Il valore normale è di 15 milioni di spermatozoi per ogni millilitro di volume di eiaculato o 39 milioni per l’intero campione. Concentrazione: un campione di liquido seminale dovrebbe contenere un numero di spermatozoi superiore o uguale a 15.000.000 per ml. Concentrazioni di spermatozoi inferiori danno OLIGOSPERMIA.
Si definiscono le seguenti condizioni patologiche:
- “oligozospermia” quando il numero degli spermatozoi è < 15×106/ml;
- “azoospermia” quando si ha totale assenza di spermatozoi nell’eiaculato;
- “criptozoospermia” per campioni con una concentrazione < 1×106/ml;
- “polizoospermia” quando il numero degli spermatozoi è >250×106/ml.
Motilità
La motilità è uno dei parametri fondamentali valutati nello spermiogramma. La coda permette allo spermatozoo un movimento “flagellare” che deve essere anterogrado, cioè deve permetterne lo spostamento in avanti. Entro 2 ore dalla eiaculazione, viene valutata la percentuale di spermatozoi che conservano un moto flagellare che viene descritto come moto rettilineo rapido (A), moto rettilineo lento (B) o moto irregolare (C).
Si valuta generalmente a fresco, generalmente su un vetrino con coprioggetto da 22×22. Il preparato così ottenuto viene esaminato con ottica in contrasto di fase a 200x o 400x ingrandimenti e si contano 200 spermatozoi intatti (non contare code mobili senza la testa). Viene valutata la percentuale di spermatozoi mobili e progressivi (mobili che si muovono). Le classi di motilità sono:
- PROGRESSIVA (PR) - spermatozoi che si muovono rapidamente sia con moto rettilineo che in grossi cerchi senza tener conto della velocità, ma valutando la loro progressione. Si intende: motilità progressiva rapida: progressione rettilinea(a) - motilità progressiva lenta: movimento rettilineo lento(b)
- NON PROGRESSIVA (NP) - spermatozoi che si muovono senza progressione, movimento in situ. motilità non progressiva: gli spermatozoi girano su se stessi senza avanzare(c)
- ASSENTE (IM) - spermatozoi immobili. immotilità: gli spermatozoi fermi(d)
Una motilità normale è definita da una percentuale di spermatozoi con motilità progressiva (PR) superiore al 32%. In condizioni di normalità, la percentuale di spermatozoi con moto rettilineo A+B deve essere superiore o uguale al 50%, di cui il 25% con motilità rettilinea veloce. Per valori inferiori si parla di astenozoospermia. Motilità: secondo i parametri WHO 2010, la somma di spermatozoi rapidamente progressivi (A), spermatozoi lentamente progressivi (B) e spermatozoi con mobilità in situ (C) deve essere superiore o uguale al 40%. In condizioni di motilità ridotta (A+B+C inferiore al 40%) si parla di ASTENOSPERMIA.
Morfologia
La morfologia è un altro interessante aspetto dello spermiogramma in quanto è uno dei parametri che meglio riflette la maturità e la capacità funzionale degli spermatozoi. La valutazione morfologica degli spermatozoi deve essere effettuata con particolari colorazione istologiche (Papanicolau, Giemsa, DiffQuick (oppure 319001).
Lo spermatozoo maturo è costituito da una parte anteriore ovoidale detta “testa”, seguita da un sottile flagello detto “coda” diviso in un tratto intermedio, principale e finale. Ad unione delle due porzioni vi è una struttura detta “collo”. La testa è principalmente occupata dal nucleo che nella sua parte anteriore presenta una vescicola detta “acrosoma”, la quale contiene gli enzimi necessari alla penetrazione della zona pellucida dell’ovocita.
Sebbene sia possibile effettuare una prima grossolana valutazione della morfologia, per un’analisi più accurata delle possibili anomalie è necessario compiere una colorazione del campione opportunamente preparato su vetrino. Viene valutata entro 1 ora dall’eiaculazione, preferibilmente dopo mezzora dalla raccolta.
Ogni singolo spermatozoo è composto da una testa lunga 4,0-5,5 micron, larga 2,5-3,5 micron e composta dal 40% al 70% da una regione acrosomiale. Si possono osservare molte alterazioni morfologiche della testa di uno spermatozoo (testa a punta, allungata, amorfa, tonda, doppia, con acrosoma ridotto, assente o asimmetrico). Il tratto intermedio che collega la testa con il flagello ha una lunghezza di 6,0-7,5 micron e uno spessore di 1 micron; si possono osservare inserzioni del tratto intermedio asimmetriche, oppure ispessimenti o assottigliamenti. Infine il flagello ha una lunghezza di circa 45 micron (come dieci teste), una larghezza di 0,5 micron e può presentarsi spezzato, mozzo, avvolto, gonfio o doppio. È anche importante annotare la presenza di residui citoplasmatici a livello del tratto intermedio. La presenza di forme anomale non deve superare il 70% del totale. Una quota troppo elevata (teratospermia) compromette la fertilità.
I difetti che lo spermatozoo può presentare vengono così classificati:
- difetti della testa: larga, piccola, assottigliata, piriforme, rotonda, amorfa, acrosoma ridotto;
- difetti del collo e del tratto intermedio: assente, angolato (il collo e la coda formano un angolo di novanta gradi), inserzione asimmetrica del tratto intermedio sulla coda, tratto intermedio spesso o irregolare, tratto intermedio sottile;
- difetti della coda: corta, multipla, a forcina, rotta, angolata, arrotondata.
In uno spermiogramma normale ci dovrebbero essere il 4% o più di spermatozoi normali. Se è inferiore a questo valore si chiama Teratozoospermia. Morfologia: secondo i parametri WHO 2010, un campione di liquido seminale normale deve contenere almeno il 4% di spermatozoi normoconformati. È da sottolineare che è normale una morfologia alterata fino al 94%, senza che questa da sola comporti problemi di fertilità.
Agglutinazioni
La presenza di spermatozoi riuniti insieme a formare “grappoli” è detta agglutinazione. Si definiscono agglutinazioni specifiche quelle in cui gli spermatozoi mobili aderiscono tra di loro, testa-testa, coda-coda o in forma mista. La presenza di agglutinazioni non è sufficiente per dedurre una causa immunologica di infertilità, ma è suggestiva della presenza di anticorpi antispermatozoo.
Il test utilizzato è il MAR test o Immunobead che risulta patologico quando più del 50% degli spermatozoi presenta particelle adese alla testa, al collo, o alla coda. Presso il Centro Clinico San Carlo viene a tale proposito effettuato il test di agglutinazione mista Mar-test: una frazione di liquido seminale viene posta per 10 minuti a contatto con una soluzione contenente particelle di lattice marcate con immunoglobuline G e si valuta l’eventuale formazione di agglutinazioni tra gli spermatozoi. Se gli spermatozoi si muovono liberamente, il Mar-test ha esito negativo: assenza di anticorpi antispermatozoi e dunque non sussistenza di una radice immunologica dell'infertilità maschile. Riflette il numero di spermatozoi uniti ad altre cellule o particelle.
Vitalità
La vitalità degli spermatozoi è definita dalla percentuale di cellule vive, valutata in laboratorio con un colorazione specifica. La percentuale di spermatozoi vitali viene valutata identificando quelli con membrana cellulare intatta, e cioè si valuta la loro capacità di non accettare sostanze dall’esterno. La valutazione va effettuata preferibilmente entro 30 minuti.
La sostanza usata è l’eosina che va mescolata con uguale volume di liquido seminale; si distinguono le forme vive da quelle morte, osservando, in un campo, quanti spermatozoi risultano colorati di rosso (spermatozoi morti) e quanti di bianco (spermatozoi vivi) Le linee guida del WHO ritengono opportuno effettuare la valutazione della vitalità per campioni con meno del 40% di motilità progressiva. La presenza di un’ampia percentuale di spermatozoi vitali ma immobili può essere indicativa di alterazioni strutturali del flagello. La percentuale di spermatozoi vivi deve superare il 58%.
Altri Esami e Considerazioni
Ai fini della valutazione della fertilità di un individuo, lo spermiogramma non può essere considerato come esame unico e definitivo. In presenza di parametri negativi, sul medesimo campione di liquido seminale raccolto viene eseguita la spermiocoltura con eventuale antibiogramma, per verificare la presenza di infezioni.
Gli esami (spermiogramma e spermiocoltura) vengono talora ripetuti a distanza di 7 o 20 giorni per verificare se forma e numero degli spermatozoi sono incostanti nel tempo, oppure la presenza di una infertilità permanente. La fisiologica variazione del liquido seminale nel tempo rende necessaria l’esecuzione dell’esame su almeno tre campioni prima di formulare una diagnosi sulla fertilità del soggetto esaminato. Tuttavia, ci sono altri strumenti aggiuntivi in grado di migliorare le informazioni ottenute attraverso il seminogramma convenzionale.
Non è infrequente inoltre il riscontro di variazioni quantitative fino al 20% quando differenti esaminatori contano lo stesso campione (la motilità e la forma degli spermatozoi vengono di solito valutati soggettivamente da un tecnico). Negli ultimi anni si è oramai consolidata in moltissimi laboratori la scelta di automatizzare lo spermiogramma per ovviare proprio a questo tipo di problema. In commercio esistono, essenzialmente, due tipologie di strumenti automatici con principi di lettura del campione diversi tra loro.
Un primo tipo è denominato Sistema C.A.S.A. ed è basato su un’analisi di immagini. In pratica, le immagini sono catturate da un video monitor collegato ad un PC. I risultati, soggetti ai settaggi del Sistema C.A.S.A. e al frame rate, pixel e formato output video, possono far variare i risultati. Altra limitazione è la quantità di campione testato che è pari a 10 microlitri il che, su un campione da 2-5 mL determina una frazione testata di 0,2-0,5 microlitri.
Conta: precalibrazione automatica basata sul sistema elettro-ottico (spettrofotometria) con un CV minore del 2%. Motilità: sistema automatico basato su metodo elettro-ottico oggettivo (modulazione del segnale causato dal movimento degli spermatozoi rilevato dallo strumento), con CV minore del 3%. Morfologia: sistema automatico. Parametro calcolato (algoritmo di proprietà) basato sulla correlazione tra la motilità progressiva e la morfologia normale, con CV minore del 3%.
Tabella dei Valori di Riferimento (WHO, 2010)
I parametri di riferimento del WHO 2010 i valori sottoindicati sono considerati normali(5° percentile):
| Parametri Seminali | Valori di Riferimento |
|---|---|
| Volume seminale | ≥ 1.5 ml |
| pH | ≥ 7.2 |
| Concentrazione spermatozoi (milioni/ml) | ≥ 15×106 |
| Numero totale spermatozoi/eiaculato (milioni) | ≥ 39x106 |
| Motilità (%) | ≥ 32% motilità progressiva (PR) |
| Morfologia (%) | ≥ 4% |
| Vitalità (%) | ≥ 58% |
| Leucociti | < 1×106/ml |
| Immunobead test o MAR test | < 50% spermatozoi con particelle adese |
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