Scopri i Segreti della PCR e dell'Elettroforesi su Gel: Principi Fondamentali e Applicazioni Incredibili!

Questo articolo esplora in dettaglio la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) e il suo utilizzo combinato con l'elettroforesi su gel. La PCR consente l’amplificazione di qualsiasi frammento di DNA di cui siano note le estremità.

PCR: Amplificazione del DNA

Primer

Il requisito fondamentale per eseguire una PCR è conoscere le estremità del frammento che si vuole amplificare. La necessità di questo requisito risiede nell’impossibilità della DNA polimerasi (l’enzima implicato nella replicazione del DNA) di iniziare autonomamente la sintesi del nuovo filamento di DNA. Conoscendo le estremità è quindi possibile sintetizzare due primer a singolo filamento ad esse complementari in modo tale da fornire alla DNA polimerasi un estremità 3’OH libera che funga da innesco della reazione.

Taq Polimerasi

La Taq Polimerasi è una DNA polimerasi termostabile isolata dal batterio Thermophilus acquaticus.

Controlli Positivo e Negativo

Senza il controllo positivo e negativo non si può essere sicuri del risultato ottenuto da una PCR. Il controllo positivo è costituito da un campione che contiene con certezza (oltre a tutte le sostanze precedentemente elencate) la sequenza bersaglio. Ci si aspetta, quindi, che dia un risultato positivo, ovvero un amplificato. In questo modo, qualora il controllo positivo non dia un amplificato in seguito alla reazione di polimerizzazione, è possibile affermare che qualcosa nelle sostanze utilizzate non funziona come dovrebbe (reagenti scaduti, l’enzima non funziona in maniera ottimale, ecc.). Il controllo negativo invece manca della sequenza bersaglio, ergo, in seguito alla reazione di polimerizzazione, ci si aspetta un risultato negativo, ovvero l’assenza di amplificato.

Una volta che avrete tutto ciò che serve dovrete mischiare tutto (meno i controlli) in un tubino piccolino e posizionare il vostro tubino (e i due tubini dei controlli) all’interno del termociclatore. In realtà la cosa è un po’ più scientifica di così, nel senso che la quantità (o meglio, i microlitri) di ogni sostanza menzionata nella lista sono da rispettare tassativamente per la corretta riuscita della reazione. Concentriamoci invece sul principio della reazione di PCR. Insomma che succede dentro al tubino?

Fasi della PCR

L’abbassamento della temperatura di reazione dà inizio al secondo step: l’annealing (o appaiamento).
In questa fase, si verifica l’appaiamento delle sequenze primer a singolo filamento con le estremità del frammento del DNA stampo da amplificare.
Ovviamente questo appaiamento è consentito grazie alla denaturazione avvenuta nello step precedente.
Se lo stampo da amplificare fosse ancora a doppio filamento i primer non potrebbero appaiarsi a un bel niente.
Nell’ultima fase si verifica la sintesi del nuovo filamento da parte della Taq polimerasi.

L’insieme di questi tre step viene denominato ciclo e una reazione di PCR è composta da numerosi cicli (dai 30 ai 40-45). Ad ogni ciclo le molecole di DNA presenti nel tubino raddoppiano rispetto al ciclo precedente.

Adesso per visualizzare il vostro amplificato (o per prendere coscienza del fatto che, ahimè, il vostro amplificato non c’è proprio) dovete caricare la vostra reazione di PCR su un gel (solitamente agarosio) ed eseguire un’elettroforesi su gel.

Elettroforesi: Separazione di Macromolecole

L’elettroforesi è una tecnica analitica che consente la separazione in liquido di macromolecole cariche, poste in un campo elettrico, attraverso la migrazione differenziale delle stesse in matrice di agarosio o poliacrilamide. Questa tecnica consente quindi la separazione di proteine e acidi nucleici in base alle dimensioni e/o cariche delle molecole in questione. Il principio chimico-fisico su cui si basa l’elettroforesi consiste nella risposta che molecole cariche producono se immerse in un campo elettrico: queste, infatti, tenderanno a muoversi lungo le linee del campo di modo che gli ioni positivi migrino verso il polo negativo e quelli negativi verso il polo positivo.

La mobilità delle molecole varia in base alle dimensioni, alle cariche elettriche e alle forme delle molecole, alla differenza di potenziale associata al campo elettrico applicato e alla natura del materiale di cui è composto il gel.

Dove Ue è la mobilità elettroforetica, ε la costante dielettrica, ζ il potenziale zeta, f(ka) la funzione di Henry e η la viscosità del solvente. Mentre la costante dielettrica quantifica la tendenza del materiale a contrastare l’intensità del campo elettrico applicato, il potenziale zeta prende in considerazione le due fasi differenti all’interno della cella elettrolitica: quella liquida nella quale sono presenti le molecole da analizzare e quella solida costituita dai due elettrodi che vengono raggiunti dalle diverse molecole durante la corsa elettroforetica. Il potenziale zeta, infatti, è la tensione che si genera dalla formazione di un doppio strato elettrico e quindi di un’interfaccia solido-liquido in corrispondenza della quale si instaura un trasferimento di carica.

Elettroforesi delle Proteine

L’elettroforesi delle proteine è la tecnica più ampiamente utilizzata in tutti i laboratori di biochimica. Essa è utile per lo studio di soluzioni delle quali si vuole analizzare il contenuto proteico: l’osservazione della migrazione delle diverse molecole, infatti, fornisce uno spettro finale che rispecchia le caratteristiche delle proteine presenti in soluzione. La caratteristica principale per cui si distingue l’elettroforesi proteica da quella volta all’analisi del DNA sta nella matrice: quella più usata per lo studio dei polipeptidi è la poliacrilamide, da cui deriva il nome PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis, con cui si indica il processo di elettroforesi proteica.

Vengono impaccati due gel con distinte porosità, ottenuti facendo co-polimerizzare acrilamide con metilenbisacrilamide. Il gel di impaccamento, o stacking gel, serve a favorire la concentrazione del campione in una zona molto stretta del gel per migliorare la risoluzione delle bande, prima di entrare nel gel di corsa. Il gel di corsa, o running gel, è necessario per ottenere la separazione delle proteine. Per visualizzare la traccia elettroforetica, infine, si può utilizzare il colorante Coomassie brilliant blue R-250 oppure la tecnica del silver staining. Nel primo caso il gel viene immerso nella soluzione colorante così che si formino interazioni ioniche tra i gruppi solfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine, oltre a interazioni di Van der Waals. L’eccesso di colorante viene eliminato immergendo il gel in una soluzione di etanolo e acido acetico. Nel secondo caso le proteine sono trattate in modo da diventare sensibili all’argento e poi con un sale dello stesso metallo (in genere nitrato).

Una soluzione di sviluppo contenente formaldeide fa precipitare l’argento legato alle proteine riducendo i cationi ad argento metallico. La riduzione viene poi fermata con EDTA. Esistono vari tipi di elettroforesi di proteine. E’ possibile separare le proteine in condizioni native sulla base delle dimensioni e della carica (elettroforesi nativa), per punto isoelettrico (isoelettroforesi), oppure solamente in base alle loro dimensioni (SDS-PAGE). In ogni caso bisogna considerare che la velocità di migrazione sarà sempre direttamente proporzionale al campo elettrico applicato e alla carica della molecola, mentre risulterà inversamente proporzionale alla viscosità del mezzo e alle dimensioni della molecola (massa molecolare e forma). Altro tipo di elettroforesi proteica è quella capillare: sono utilizzati tubi sottili e stretti di diametro interno compreso fra i 20 e i 100 micron, di modo che il calore possa essere velocemente dissipato per poter usare campi elettrici molto alti con la contemporanea riduzione dei tempi di separazione ad alcuni minuti.

SDS-PAGE

L’elettroforesi SDS-PAGE consiste in un tipo di corsa elettroforetica in cui le molecole proteiche vengono distinte esclusivamente in base alla loro massa. Il nome di questo tipo di tecnica ci indica il suo principale componente: il sodio dodecil-solfato (SDS). L’SDS è un tensioattivo che in presenza di proteine ne rompe i legami non-covalenti denaturandole e quindi privandole della loro forma originaria. Al campione viene aggiunto, inoltre, beta-mercapto-etanolo, che agisce da secondo denaturante rompendo i ponti disolfuro della proteina, e somministrato calore. L’estremità anionica della molecola di SDS lega i residui amminoacidici della proteina impartendo ad essa una notevole carica negativa. In questo modo alle proteine denaturate si impartisce una carica che possa uniformarle tutte. Sappiamo che, dati specifici valori di campo elettrico e di viscosità del mezzo, a parità di carica, migrerà più velocemente la molecola di raggio minore: per questo spesso viene scelta la SDS-PAGE, poiché permette di confrontare le proteine esclusivamente per quella che è la loro massa. Una volta terminato il processo di elettroforesi il gel di poliacrilamide viene posto all’interno di una soluzione di colorante, in questo caso di Coomassie brilliant blue R-250.

Isoelettroforesi (IEF)

L’isoelettroforesi, o isoelettrofocalizzazione (IEF), oppure ancora focalizzazione isoelettrica, sfrutta il punto isoelettrico caratteristico di ciascuna proteina per distinguere le molecole nella loro corsa sulla matrice di gel. Il punto isoelettrico di una molecola corrisponde a quel valore di pH per cui, se in elettroforesi, la molecola smette di migrare e si ferma. Considerando che una proteina, essendo costituita da amminoacidi, e quindi da potenziali zwitterioni, possiede entrambe le polarità, ciascun polipeptide ha un suo proprio punto isoelettrico (pI) in corrispondenza del quale si ferma in elettroforesi. Se si sottopone una miscela di proteine a elettroforesi attraverso una soluzione o un gel con un gradiente stabile di pH, in cui il pH aumenta in modo regolare dall’anodo al catodo, ciascuna proteina migrerà fino alla posizione corrispondente al suo pI. Il campione è prima sottoposto a IEF in una direzione, quindi le molecole proteiche vengono distinte mediante SDS-PAGE nella direzione perpendicolare.

Elettroforesi Nativa vs. Denaturante

Una elettroforesi nativa potrebbe dare risultati ingannevoli a causa della forma della molecola, perciò in genere si preferiscono quelle denaturanti. Tuttavia, consente di preservare l’attività biologica della proteina, di identificare la posizione della proteina nel gel mediante specifici saggi funzionali e di recuperarla in forma attiva, ed è indicata per evidenziare la contemporanea presenza di forme monomeriche e oligomeriche di una specie proteica pura. Bisogna però considerare che non si può conoscere a priori la mobilità elettroforetica della proteina, né ne si possono identificare le dimensioni, quindi il risultato resta poco affidabile.

Elettroforesi degli Acidi Nucleici

L’elettroforesi degli acidi nucleici viene principalmente utilizzata per l’analisi di frammenti di DNA. Questa segue gli stessi principi elettrochimici dell’elettroforesi proteica anche se prevede metodiche leggermente differenti. La prima differenza fra un’elettroforesi proteica e una svolta sugli acidi nucleici sta nel fatto che le molecole in questione nel secondo caso sono sempre cariche negativamente. Data la struttura di base di DNA e RNA, infatti, essendo i nucleotidi composti da una molecola di ribosio, una base azotata e un fosfato, le molecole sono necessariamente a carica fortemente negativa. Inoltre, in questo tipo di elettroforesi varia la matrice: non si parla più di poliacrilamide ma di gel di agarosio, un polimero polisaccaride purificato dall’agar-agar, sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle alghe rosse. Altra differenza sta nella posizione della cella elettrolitica: se nel caso dell’elettroforesi proteica il gel di acrilamide viene posto verticalmente, nel caso si analizzino acidi nucleici il gel di agarosio si dispone orizzontalmente.

Nel caso di elettroforesi di DNA, inoltre, si utilizzano enzimi di restrizione e quindi proteine appartenenti alla classe delle idrolasi: si tratta di deossiribonucleasi II sito-specifiche. Questi enzimi sono capaci di frammentare il doppio filamento del DNA agendo in modo da tagliare entrambi i filamenti ad una stessa altezza. In questo modo il genoma viene degradato in sezioni di tutte le grandezze e può poi così essere analizzato in elettroforesi. Per quanto riguarda la visualizzazione dello spettro elettroforetico finale, nel caso degli acidi nucleici non si utilizzano coloranti semplici come nel caso delle proteine, bensì composti che in genere risultano agenti intercalanti per il genoma stesso. Il più utilizzato è il bromuro di etidio. Questa molecola, completamente planare, possiede atomi tutti ibridizzati sp2 grazie ai doppi legami coniugati che li uniscono. Si presenta così di spessore paragonabile a quello delle basi azotate fra le quali può incunearsi (intercalare): una volta che il bromuro di etidio intercala, la fluorescenza della sezione di DNA se illuminato da raggi UV aumenta di circa 100 volte.

Elettroforesi su Gel di Agarosio

L’elettroforesi degli acidi nucleici utilizza una matrice diversa che si compone di gel di agarosio. L’elettroforesi su gel di agarosio è utile per analizzare la grandezza dei singoli frammenti di DNA e per andare a valutare la presenza di specifiche sequenze di DNA. Per analizzare la dimensione dei frammenti si utilizza una soluzione, da inserire nel primo pozzetto, contenente frammenti DNA di dimensioni note. In questo modo confrontando il percorso svolto da questi frammenti con quelli presenti negli altri pozzetti si potranno osservare le effettive dimensioni degli stessi. Per quanto riguarda la presenza di specifiche sequenze di DNA, invece, si utilizzano tecniche specifiche che sfruttano sonde a DNA marcate con sostanze radioattive: in questo modo le sonde si legheranno ai singoli filamenti ad esse complementari così che specifiche sequenze possano essere ritrovate nel gel.

Fattori che influenzano la velocità di migrazione

Peso molecolare
Concentrazione di agarosio
Conformazione DNA
Voltaggio applicato
Intercalanti
Tampone di elettroforesi

L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici.

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l’etidio bromuro. Questa molecola planare si inserisce (intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette luce fluorescente quando irradiata con luce ultravioletta (300 nm). L’etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), al campione, o, alternativamente, dopo l’elettroforesi.

Visualizzazione dei Risultati

Il risultato dell’elettroforesi di DNA viene osservato al transilluminatore.

In sintesi, l'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa.