Protocollo Definitivo per l'Inclusione in Paraffina: Guida Completa per Preparati Istologici Perfetti

L’allestimento di preparati microscopici implica una serie di operazioni fondamentali per l'analisi dettagliata dei tessuti. Queste operazioni consistono in: prelievo di frammenti d’organo, fissazione, inclusione e colorazione.

Prelievo e Fissazione dei Frammenti d'Organo

Il prelievo di frammenti d’organo va condotto al più presto sul materiale fresco. Se, in teoria, i metodi di osservazione delle cellule allo stato vitale sarebbero da preferirsi in quanto consentono uno studio dinamico della cellula, in assenza di artefatti di immagine prodotti dalle fasi successive di allestimento del campione, in realtà il loro impiego è limitato perché le cellule ed i tessuti isolati dall’organismo non sopravvivono che per tempi brevi (a meno che non siano coltivati in vitro) in quanto gli enzimi litici intracellulari si attivano rapidamente e distruggono la cellula (autolisi) provocando gravi alterazioni di struttura. In secondo luogo, frammenti spessi di tessuto non permettono un’analisi citologica fine e quindi diventa necessario lavorare con tessuti uccisi chimicamente, prima che intervengano gli enzimi autolitici, e tagliarli in sezioni sottili che possano essere osservate al microscopio, eventualmente previa colorazione.

La fissazione consiste nel trattamento del frammento d’organo con procedimenti chimici o fisici capaci di preservare e stabilizzare i costituenti dei tessuti, inattivando nel contempo gli enzimi autolitici. La fissazione di organi interi non è in genere buona norma, in quanto, a parte l’impossibilità di alcune situazioni, la penetrazione lenta del liquido ha l’inconveniente di permettere l’autolisi delle parti che tardivamente vengono a contatto col fissativo. La fissazione dura da pochi minuti fino a 24-48 ore a seconda della grandezza del frammento. Il rapporto fissativo/campione deve essere di 20:1. Ogni fissativo all’atto di provvedere alla stabilizzazione delle strutture provoca degli artefatti di struttura, ossia immagini inesistenti prima della fissazione.

Ciò comporta che il metodo venga di volta in volta scelto opportunamente in rapporto al tipo di strutture che si desiderano studiare e, di conseguenza, alla colorazione da adottare. Nella scelta di un fissativo va anche tenuto presente che esso non deve svolgere azione estrattiva sui componenti che si desiderano identificare. Così, ad esempio, i fissativi in soluzione acquosa sono controindicati quando si debba studiare la distribuzione del glicogeno, in quanto tale sostanza è solubile in acqua. In questa evenienza è indispensabile l’uso dell’alcool etilico assoluto che precipita il glicogeno. I fissativi maggiormente usati sono la formaldeide (o formalina) al 10% e l’alcool etilico a 90°. Soprattutto la prima viene particolarmente raccomandata in quanto consente la realizzazione dei più comuni metodi di colorazione per uso diagnostico. È maggiormente usata la formalina tamponata per evitare variazioni di pH che possano alterare le proprietà antigeniche di alcuni antigeni.

L’aldeide formica ha un forte odore e per evitare danni all’apparato respiratorio conseguenti alla sua inalazione, si devono usare cappe o almeno tenere aperte le finestre. È cancerogena per le vie respiratorie e teratogena, cioè danneggia il feto nel 1° trimestre di gravidanza. Non bisogna mai usare la soluzione fisiologica in quanto l’acqua entrerebbe nelle cellule per osmosi facendole scoppiare. Altri fissativi sono: gluteraldeide, cloruro di mercurio, acido picrico. I migliori fissativi sono quelli che determinano una precipitazione dei componenti cellulari in minutissimi granuli.

I fissativi contenenti acidi (come l’acido picrico) sono molto penetranti e molto rapidi, ma determinano l’addensamento della struttura nucleare. Bisogna considerare che nel caso si vogliano effettuare studi immunoistochimici, la formalina richiede successive tecniche di smascheramento antigenico in quanto questo fissativo crea ponti metilenici con le proteine alterandone la struttura. La formaldeide non permette di scendere all’individuazione di fini dettagli citologici, dato che le cellule vanno incontro a raggrinzamenti e retrazioni. Ne consegue che per indagini analitiche si consigliano altri fissativi o, meglio, miscele di fissativi.

Alcuni fissativi fungono anche da coloranti come nel caso dell’acido osmico, usato per la dimostrazione dei lipidi. Una tecnica di fissazione molto utilizzata è il congelamento-essiccamento: si ricopre il materiale da fissare con una resina e lo si espone a vapori di azoto liquido alla temperatura di -170 - -190 °C, completando l’operazione a -30 - -40 °C. Questa tecnica ha il vantaggio di una rapida fissazione e non necessita di una successiva fase di smascheramento antigenico se si vogliono usare tecniche immunoistochimiche. Per fissare il tessuto, infine, spesso si usano miscele di varie sostanze; le più note sono: miscela di Bouin, di Zenker, di Susa, di Carnoy e di Orth.

Inclusione in Paraffina

L’inclusione consiste nel lasciar permeare il tessuto da una sostanza che solidifica a temperatura ambiente atta a consentire il taglio in sezioni sottili dello spessore di pochi micron. Essa è correntemente rappresentata dalla paraffina. Trattandosi di una sostanza idrofoba, la sua penetrazione richiede che dal tessuto venga allontanata l’acqua a mezzo di un disidratante. Si usa all’uopo una serie di soluzioni di alcool etilico a gradazione crescente fino a portare il pezzo in alcool assoluto. Da qui il tessuto viene trasferito in un solvente della paraffina che di solito è lo xilolo.

Esso ha la funzione di consentire la penetrazione del mezzo includente. La paraffina, il cui punto di fusione varia tra 52 e 60 °C, è usata allo stato liquido, quindi l’operazione viene praticata in termostato. Una volta che la compenetrazione è avvenuta, il pezzo viene rapidamente raffreddato, così da acquistare la consistenza della paraffina solida. Del tessuto incluso si ottengono fette di 3-10 µm, usando un microtomo a lama d’acciaio. Data la sottigliezza, queste risultano difficilmente maneggevoli, quindi vengono montate su un vetrino portaoggetto.

Colorazione e Montaggio

Per provvedere alla loro colorazione si suole allontanare la paraffina e riportare il tessuto al suo primitivo stato d’idratazione. Così le sezioni vengono dapprima immerse in xilolo, quindi in una serie di soluzioni di alcool a gradazione decrescente fino all’acqua. A questo punto si può procedere alla colorazione e al montaggio, ossia all’applicazione di un vetrino coprioggetto che viene fatto aderire al primo mediante una resina naturale o sintetica.

Un’inclusione in un materiale più duro può essere ottenuta utilizzando plastiche quali resina epossidica. L’infiltrazione del frammento da includere viene fatta con plastica allo stato momomerico nel quale essa è fluida; viene quindi indotta la solidificazione del frammento infiltrato facendo polimerizzare la plastica mediante calore o raggi ultravioletti. Trattandosi di un materiale di inclusione molto duro, la plastica consente di ottenere sezioni sottili dello spessore di poche centinaia di nanometri che possono essere osservate al microscopio elettronico.

Nel caso di organi i cui componenti abbiano consistenza disomogenea, come il nevrasse e l’osso, si preferisce l’inclusione in celloidina o in resina. Solo nel caso di tessuti calcificati all’inclusione viene fatta precedere la decalcificazione, per la quale si ricorre all’uso di acidi diluiti ovvero di chelanti, come l’acido tetracetico dell’etilendiamina (EDTA). Vi sono poi eventualità nelle quali non è possibile l’uso dell’inclusione, per esempio quella in cui si vogliano studiare i grassi neutri, i quali sono solubili in alcool ed in xilolo.

Si ricorre in tal caso all’uso del microtomo congelatore. Con questo strumento si conferisce al pezzo la durezza necessaria per essere sezionato a mezzo del congelamento estemporaneo con neve carbonica. Trova anche largo impiego il criostato che consta di una camera termicamente isolata entro la quale è collocato il microtomo. La temperatura della camera è mantenuta tra i -15 ed i -30 °C.

Colorazione dei Tessuti

La colorazione viene praticata principalmente per mettere in risalto singoli componenti strutturali. In altri casi viene eseguita al fine di identificare costituenti chimici particolari del tessuto. Se il tessuto da esaminare consiste in un monostrato di cellule (per esempio cellule coltivate in vitro, preparati per striscio di sangue circolante o preparati per schiacciamento), esso viene di solito osservato direttamente al microscopio. Negli altri casi, invece, si procede con la colorazione. I coloranti sono di due tipi: naturali e sintetici.

I primi possono essere di origine tanto animale che vegetale. I secondi, prodotti in laboratorio, sono derivati dall’anilina. I coloranti, ancora, si distinguono in vitali e sopravitali.

Coloranti Vitali e Sopravitali

I coloranti vitali hanno la proprietà di essere assunti attivamente da alcune cellule viventi permettendo così la loro identificazione o lo studio di funzioni particolari. Esempi di coloranti vitali sono:

Alizarina, incorporata elettivamente nella sostanza fondamentale dell’osso in corso di calcificazione, colorandola di rosso.
Blu Triptan, litio carminio, blu pirrolo, che sono fagocitati dai macrofagi permettendo così la loro individuazione.
Verde Janus, che colora elettivamente i mitocondri in virtù delle proprietà ossido-riduttive di questi organuli.
Rosso neutro, che colora i granuli specifici dei leucociti (in rosa quelli dei granulociti neutrofili, in giallo quelli degli eosinofili e in rosso mattone quelli dei basofili).
Blu di metilene, che colora l’assone dei neuroni.

I coloranti sopravitali, invece, sono somministrati a cellule o a tessuti isolati dall’organismo.

Classificazione Chimica dei Coloranti

I coloranti si legano ai tessuti mediante legami chimici con le proteine, gli acidi nucleici, le glicoproteine e le lipoproteine. Da un punto di vista chimico, quindi, i coloranti sono classificati in due categorie: coloranti acidi, nei quali il gruppo cromoforo è acido (anionico) e coloranti basici, nei quali il gruppo cromoforo è basico (cationico).

I coloranti acidi più comuni sono: eosina, arancio G, verde luce. I coloranti basici più comuni sono: blu di metilene, blu di toluidina, tionina, verde di metile, pironina, azzurro B, fucisina basica.

I componenti dei tessuti che hanno affinità per i coloranti acidi sono detti acidofili; quelli che mostrano affinità per i coloranti basici sono detti basofili. Bisogna considerare, però, che l’acidofilia e la basofilia dei vari costituenti cellulari dipendono dal pH della soluzione colorante.

Ai valori di pH comunemente impiegati per una determinata colorazione istologica (pH = 6), la cromatina del nucleo, l’ergastoplasma, le mucoproteine e i glicosaminoglicani assumono i coloranti basici, mentre gli eritrociti, i granuli dei granulociti eosinofili ed alcune parti del citoplasma legano coloranti acidi.

I coloranti sono di regola indiretti in quanto la loro fissazione al tessuto necessita l’impiego di mordenzatori, ossia degli ossidanti (acido fosfomolibdico, acido picrico, acido fosfowolframico, acido cromico, permanganato di potassio, ecc.) che fungono da mezzo intermediario di collegamento tra struttura tissutale e colorante, fra i quali non esiste una particolare affinità.

Metodi di Colorazione

I metodi di colorazione prevedono spesso l’uso di più coloranti, ciascuno capace di mettere in evidenza un particolare componente strutturale. In tal senso i singoli coloranti possono essere applicati successivamente ovvero contemporaneamente sotto forma di miscele bilanciate. Sono colorazioni di semplice attuazione che vengono usate soprattutto per avere una rapida diagnosi del tessuto osservato. Esse danno una specifica e chiara risposta sulla topografia, sulla conservazione e sulle condizioni generali del preparato. Queste colorazioni si basano sul principio generale dell’affinità dei coloranti per un determinato tessuto o per il suo valore di pH.

Quelli basici (emallume, fucsina basica, carmallume) colorano le strutture acide presenti sia nelle cellule (ad es. nucleo, ribosomi) che nei tessuti, (ad es.cartilagine, secreti acidi) mentre quelli acidi (eosina, acido picrico) colorano i componenti basici sia cellulari (ad es. citoplasma) che tissutali (tessuto osseo, connettivo). È la colorazione sicuramente più usata nei vari laboratori di istopatologia. Il nucleo e i vari componenti acidi del citoplasma vengono colorati in blu-viola dall’emallume, un colorante vegetale basico di cui esistono diverse varianti (ad es. di Mayer o Carazzi).

Colora in nero intenso le strutture acide e i contorni cellulari. Grazie alla sua affinità per alcune componenti presenti nei diversi tessuti mette bene in evidenza i confini cellulari e le striature trasverse delle fibre muscolari. Molte di queste colorazioni derivano dal metodo originale di Mallory. Le varianti più comunemente usate sono quelle di Masson, di Galgano e di Heidenhain.

Queste colorazioni hanno la particolarità di affiancare ad un colorante basico due o più coloranti acidi che, grazie all’intervento di acidi deboli detti mordenzanti (acido fosfowolframico o fosfomolibdico), differenziano in modo più preciso le varie componenti tissutali. In istologia il termine mordenzante indica composti chimici che oltre a fungere da catalizzatori inibiscono o accrescono le affinità di alcuni coloranti verso determinati componenti tissutali.

Questa colorazione deriva dal metodo di Mallory. Come le altre colorazioni tricromiche si basa, oltre che sulle proprietà acido-basiche dei tessuti, anche sulla diversa affinità dei vari coloranti acidi usati. Nella variante di Heidenhain, l’azocarminio colora le strutture acide di rosso-porpora molto acceso, mentre le strutture basiche (fibre collagene, tessuto osseo, muco) reagiscono con il blu di anilina o il violetto arancio (tessuto muscolare) dell’orange G.

Il citoplasma, in generale, sarà arancione pallido. Con questa colorazione otteniamo una netta separazione tintoriale tra il tessuto muscolare e quello connettivo. Si noti che questa metodica è incompatibile con alcuni fissativi . Con questa metodica il colorante basico, l’emallume di Mayer, colora le strutture acide in violetto intenso, mentre i coloranti acidi sono blu di anilina e orange G. Galgano mod. I nuclei sono colorati in viola, il connettivo in blu, il secreto intracitoplasmatico di alcune cellule epiteliali in giallo-ocra. È particolarmente indicata per riconoscere i vari tipi di cellule del connettivo.

Colora i nuclei in viola con l’ematossilina; il citoplasma in rosso più o meno vivo con la fucsina acida, il connettivo e le strutture fortemente basiche in blu con il blu di anilina. È una tricromica con colori particolarmente brillanti. Viene usata l’affinità dell’Aurantia, colorante acido, per il tessuto muscolare. Avremo così nuclei colorati in viola intenso da una qualsiasi emallume, il connettivo in azzurro per l’azione della miscela di Mallory e il muscolare in giallo ocra.

Colorazioni Elettive

Quando si vuole mettere in evidenza una componente tissutale particolare (ad es. le fibre reticolari o elastiche) o esaltarne un’altra che, per le sue caratteristiche chimiche o strutturali risulta di difficile evidenziazione (ad es. le fibre nervose), si usano metodi e coloranti specifici: queste colorazioni vengono dette elettive. É il metodo originale per la colorazione delle fibre reticolari altamente affini all’argento metallico, tanto che possono essere definite anche fibre argirofile.

Siccome è di difficile esecuzione prevede molte varianti dal Gomori, all’ Achuarro-Del Rio Ortega, al Tibor-Papp. Di fondo c’è una fissazione prolungata in formalina, da dieci giorni a due-tre mesi, l’uso di una soluzione ammoniacale d’argento che, depositandosi elettivamente sulle fibre reticolari e, successivamente ridotto ad argento metallico, assume la caratteristica colorazione nera intensa del metodo. È una colorazione specifica per le fibre elastiche che vengono colorate selettivamente in nero-viola su un fondo praticamente incolore.

Weigert per le fibre elastiche. Queste colorazioni servono per evidenziare elettivamente le goccioline lipidiche contenute nelle cellule adipose. Le sezioni si ottengono da pezzi congelati e tagliati al criostato in modo da evitare i successivi passaggi nei solventi organici necessari per l’inclusione in paraffina che scioglierebbero irrimediabilmente le goccioline lipidiche. Il Sudan III colora le goccioline lipidiche in giallo-arancio mentre il Sudan Black le colora in nero.

Questo tessuto,a causa della sua durezza, crea molti problemi tecnici, sia nell’inclusione che, soprattutto, nel taglio. Per questo motivo, quando la metodica non lo sconsigli, si tende a decalcificare i pezzi in modo da eliminarne la parte inorganica. I liquidi decalcificanti (EDTA, acido nitrico, acido cloridrico) sono molto invasivi e a volte, se non usati con estrema cura, rovinano irrimediabilmente il tessuto da analizzare.

Colorazioni per il Tessuto Nervoso

Le caratteristiche del tessuto nervoso associate alla sua delicatezza fanno sì che sia estremamente difficile ottenere preparati di buona qualità e durevoli nel tempo. Si possono ottenere preparati da pezzi colorati in toto e poi inclusi in paraffina e tagliati, oppure ottenuti dopo colorazione per schiacciamento fra due vetrini o, infine, con metodi tradizionali. È una colorazione per il sistema nervoso centrale e si usa su sezioni in paraffina di 10 µm di spessore.

E’ relativamente semplice, mette in evidenza la zona tigroide del Nissle, caratteristica del citoplasma dei neuroni, colorandola con il blu-azzurro tipico del blu di toluidina. Piccoli pezzi molto freschi di sistema nervoso centrale vengono trattati da 1 a 5-6 giorni (a seconda dell’animale, delle dimensioni del pezzo e delle sue caratteristiche) in soluzione osmio-bicromica, in termostato a 25°C. Quando è possibile, è indicata una pre-fissazione con paraformaldeide al 2% per perfusione, per prevenire del tutto fenomeni di necrosi cellulare.

Il pezzo viene poi colorato con nitrato d’argento all’1% in acqua. La reazione, a seconda delle caratteristiche e delle dimensioni del pezzo, può durare fino a 3 giorni. A colorazione avvenuta si includono i pezzi in paraffina e si tagliano, al microtomo a slitta, sezioni molto spesse, intorno a 40-50 µm, per avere una visione il più completa possibile del tessuto e dei vari costituenti cellulari. Si ha una buona colorazione quando le cellule nervose spiccano in nero intenso su un fondo color tabacco.

Anche questo è un metodo complicato e di difficile riuscita, molto usato per il sistema nervoso periferico. Si basa sull’affinità che l’argento ammoniacale ha per le fibre nervose quando viene ridotto dalla formaldeide ad argento metallico. Fattori variabili come la fissazione, il pH e la temperatura possono influenzare l’intensità e la precisione di questa impregnazione.

A colorazione avvenuta si vedranno le fibre nervose colorate in nero su un fondo grigio più o meno intenso. Per consentire di seguire adeguatamente l’andamento non rettilineo delle fibre le sezioni devono essere spesse almeno 12-14 µm. Colorazione in toto di pezzi, anche voluminosi, adatta soprattutto alla ricerca di terminazioni nervose e di grosse fibre periferiche.

Riesce su tessuto fresco a cui non siano stati fatti trattamenti preventivi, neanche un lavaggio in acqua distillata. Dopo la colorazione con cloruro d’oro, i pezzi ottenuti si macerano in glicerina per almeno sei mesi prima di prelevare piccoli frammenti e, per delacerazione, ottenere preparati da osservare al microscopio ottico. Sei mesi rappresentano il tempo minimo di macerazione e si ottengono ottimi preparati anche dopo molti anni.

Gli strisci di sangue si ottengono per strisciamento di una goccia di sangue fresco tra due vetrini coprioggetto, uno posto a 45° rispetto all’altro. Si inietta in un grosso vaso dell’animale una soluzione molto diluita di colorante vitale (di solito si usano Blu di metile o Rosso vitale diluiti 1:10000 o 1:15000). Il colorante vitale isotonico a 37°C viene iniettato per circa 5-10 min, ad intervalli di tempo costanti. Si preleva l’organo prescelto, si lascia all’aria per 10 mine poi si fissa in molibdato ammonico al 10%.