Elettroforesi Capillare delle Proteine: Scopri i Principi Fondamentali e le Applicazioni Rivoluzionarie

L'elettroforesi è una tecnica utilizzata nell'ambito delle analisi di laboratorio che sfrutta la massa molecolare e la carica elettrica delle proteine, per valutarne la quantità e la qualità. In laboratorio, l'elettroforesi è una delle tecniche più utilizzate per analizzare la composizione qualitativa e quantitativa delle proteine. In particolare, quest'esame consente di separare le proteine in cinque frazioni: albumina, alfa 1 globuline, alfa 2 globuline, beta globuline e gamma globuline. L'alterazione del rapporto tra questi tipi di proteine è indicativa di alcune condizioni patologiche.

Chiamata anche elettroforesi proteica o protidogramma, quest'esame è realizzato adottando un metodo molto particolare: al campione è applicato un campo elettrico, grazie al quale le proteine si "raggruppano" per tipologia. Ciascuna delle proteine che permette di analizzare l'elettroforesi, infatti, ha una propria massa molecolare e una carica elettrica, che consente loro di rispondere alla sollecitazione, fornita dalla corrente continua, in un modo caratteristico.

L'elettroforesi è un'analisi di laboratorio che fornisce importanti informazioni circa la quantità di proteine presenti nel siero sanguigno o in altri campioni biologici e, per ogni frazione, rivela se siano presenti delle anomalie in termini di qualità. Le proteine plasmatiche sono indicatori molto importanti: eventuali alterazioni delle loro concentrazioni possono segnalare la presenza di numerose malattie. Il risultato dell'elettroforesi permette di esaminare la concentrazione di questi parametri: l'eventuale alterazione del rapporto tra questi gruppi di proteine si osserva durante alcuni stati patologici.

Principi di base dell'elettroforesi

In generale, l'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche, attraverso una soluzione ed un mezzo di supporto poroso e inerte (come carta, gel di agarosio o foglio di acetato di cellulosa), sotto l'impulso di un campo elettrico. Molte molecole di interesse biologico (aminoacidi, peptidi, proteine, DNA e RNA) possiedono gruppi ionizzabili nella loro struttura, quindi, ad un opportuno valore di pH, queste sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche. Quando sono poste in un ambiente basico, le proteine si comportano da acidi: il gruppo COOH dei vari amminoacidi che costituiscono la struttura della macromolecola, si dissocia in COO- (particella negativa) e H+ (ione positivo).

Componenti Proteiche Analizzate

Albumina: è la più abbondante proteina nel siero, nonché una delle più importanti dell'organismo. Questa viene sintetizzata dal fegato ed è contenuta soprattutto nei liquidi interstiziali e nel plasma, dove rappresenta, da sola, circa la metà delle proteine circolanti.
Globuline alfa 1 e 2: svolgono principalmente una funzione di trasporto dei lipidi, dei grassi del sangue e degli ormoni.
Beta globuline: trasportano le sostanze presenti nel sangue; tra le più note proteine di questo gruppo vi sono la transferrina (deputata al trasporto del ferro) e la beta-2 microglobulina.

Tipi di Elettroforesi delle Proteine

Esistono vari tipi di elettroforesi di proteine. E’ possibile separare le proteine in condizioni native sulla base delle dimensioni e della carica (elettroforesi nativa), per punto isoelettrico (isoelettroforesi), oppure solamente in base alle loro dimensioni (SDS-PAGE).

Altro tipo di elettroforesi proteica è quella capillare: sono utilizzati tubi sottili e stretti di diametro interno compreso fra i 20 e i 100 micron, di modo che il calore possa essere velocemente dissipato per poter usare campi elettrici molto alti con la contemporanea riduzione dei tempi di separazione ad alcuni minuti.

Elettroforesi SDS-PAGE

L’elettroforesi SDS-PAGE consiste in un tipo di corsa elettroforetica in cui le molecole proteiche vengono distinte esclusivamente in base alla loro massa. Il nome di questo tipo di tecnica ci indica il suo principale componente: il sodio dodecil-solfato (SDS). L’SDS è un tensioattivo che in presenza di proteine ne rompe i legami non-covalenti denaturandole e quindi privandole della loro forma originaria. Al campione viene aggiunto, inoltre, beta-mercapto-etanolo, che agisce da secondo denaturante rompendo i ponti disolfuro della proteina, e somministrato calore. L’estremità anionica della molecola di SDS lega i residui amminoacidici della proteina impartendo ad essa una notevole carica negativa. In questo modo alle proteine denaturate si impartisce una carica che possa uniformarle tutte.

Sappiamo che, dati specifici valori di campo elettrico e di viscosità del mezzo, a parità di carica, migrerà più velocemente la molecola di raggio minore: per questo spesso viene scelta la SDS-PAGE, poiché permette di confrontare le proteine esclusivamente per quella che è la loro massa. Una volta terminato il processo di elettroforesi il gel di poliacrilamide viene posto all’interno di una soluzione di colorante, in questo caso di Coomassie brilliant blue R-250.

Isoelettroforesi (IEF)

L’isoelettroforesi, o isoelettrofocalizzazione (IEF), oppure ancora focalizzazione isoelettrica, sfrutta il punto isoelettrico caratteristico di ciascuna proteina per distinguere le molecole nella loro corsa sulla matrice di gel. Il punto isoelettrico di una molecola corrisponde a quel valore di pH per cui, se in elettroforesi, la molecola smette di migrare e si ferma. Considerando che una proteina, essendo costituita da amminoacidi, e quindi da potenziali zwitterioni, possiede entrambe le polarità, ciascun polipeptide ha un suo proprio punto isoelettrico (pI) in corrispondenza del quale si ferma in elettroforesi. Se si sottopone una miscela di proteine a elettroforesi attraverso una soluzione o un gel con un gradiente stabile di pH, in cui il pH aumenta in modo regolare dall’anodo al catodo, ciascuna proteina migrerà fino alla posizione corrispondente al suo pI.

Il campione è prima sottoposto a IEF in una direzione, quindi le molecole proteiche vengono distinte mediante SDS-PAGE nella direzione perpendicolare.

Elettroforesi nativa

Una elettroforesi nativa potrebbe dare risultati ingannevoli a causa della forma della molecola, perciò in genere si preferiscono quelle denaturanti. Tuttavia, consente di preservare l’attività biologica della proteina, di identificare la posizione della proteina nel gel mediante specifici saggi funzionali e di recuperarla in forma attiva, ed è indicata per evidenziare la contemporanea presenza di forme monomeriche e oligomeriche di una specie proteica pura. Bisogna però considerare che non si può conoscere a priori la mobilità elettroforetica della proteina, né ne si possono identificare le dimensioni, quindi il risultato resta poco affidabile.

Applicazioni Cliniche

Il dosaggio delle proteine totali nel sangue (proteinemia) e dell'albumina (albuminemia) è di norma inclusa nei pannelli di controllo, quindi è frequentemente usata nella valutazione dello stato di salute di una persona. Quando nelle urine è presente un'alta concentrazione di proteine, invece, il medico può richiedere l'esecuzione dell'elettroforesi delle PROTEINE URINARIE. L'elettroforesi delle PROTEINE DEL LIQUOR può essere prescritta quando si sospetta la diagnosi di sclerosi multipla.

Preparazione all'esame

Per l'elettroforesi sieroproteica (esame del sangue) è necessario sottoporsi ad un semplice prelievo di sangue dalla vena di un braccio. Prima del prelievo ematico, alcuni laboratori potrebbero richiedere di osservare un digiuno di almeno 10-12 ore. Per l'elettroforesi delle proteine urinarie (analisi delle urine) è necessario raccogliere una piccola quantità di urine in un apposito contenitore sterile.

Alcuni medicinali possono influenzare l'esito dell'elettroforesi, pertanto è consigliabile segnalare al medico eventuali terapie in corso. Bisogna sempre ricordare che i valori di riferimento possono cambiare da un laboratorio ad un altro.

Elettroforesi degli Acidi Nucleici

L’elettroforesi degli acidi nucleici viene principalmente utilizzata per l’analisi di frammenti di DNA. Questa segue gli stessi principi elettrochimici dell’elettroforesi proteica anche se prevede metodiche leggermente differenti. La prima differenza fra un’elettroforesi proteica e una svolta sugli acidi nucleici sta nel fatto che le molecole in questione nel secondo caso sono sempre cariche negativamente. Data la struttura di base di DNA e RNA, infatti, essendo i nucleotidi composti da una molecola di ribosio, una base azotata e un fosfato, le molecole sono necessariamente a carica fortemente negativa.

Inoltre, in questo tipo di elettroforesi varia la matrice: non si parla più di poliacrilamide ma di gel di agarosio, un polimero polisaccaride purificato dall’agar-agar, sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle alghe rosse. Altra differenza sta nella posizione della cella elettrolitica: se nel caso dell’elettroforesi proteica il gel di acrilamide viene posto verticalmente, nel caso si analizzino acidi nucleici il gel di agarosio si dispone orizzontalmente.

Nel caso di elettroforesi di DNA, inoltre, si utilizzano enzimi di restrizione e quindi proteine appartenenti alla classe delle idrolasi: si tratta di deossiribonucleasi II sito-specifiche. Questi enzimi sono capaci di frammentare il doppio filamento del DNA agendo in modo da tagliare entrambi i filamenti ad una stessa altezza. In questo modo il genoma viene degradato in sezioni di tutte le grandezze e può poi così essere analizzato in elettroforesi.

Per quanto riguarda la visualizzazione dello spettro elettroforetico finale, nel caso degli acidi nucleici non si utilizzano coloranti semplici come nel caso delle proteine, bensì composti che in genere risultano agenti intercalanti per il genoma stesso. Il più utilizzato è il bromuro di etidio. Questa molecola, completamente planare, possiede atomi tutti ibridizzati sp2 grazie ai doppi legami coniugati che li uniscono. Si presenta così di spessore paragonabile a quello delle basi azotate fra le quali può incunearsi (intercalare): una volta che il bromuro di etidio intercala, la fluorescenza della sezione di DNA se illuminato da raggi UV aumenta di circa 100 volte.

L’elettroforesi su gel di agarosio è utile per analizzare la grandezza dei singoli frammenti di DNA e per andare a valutare la presenza di specifiche sequenze di DNA. Per analizzare la dimensione dei frammenti si utilizza una soluzione, da inserire nel primo pozzetto, contenente frammenti DNA di dimensioni note. In questo modo confrontando il percorso svolto da questi frammenti con quelli presenti negli altri pozzetti si potranno osservare le effettive dimensioni degli stessi.

Per quanto riguarda la presenza di specifiche sequenze di DNA, invece, si utilizzano tecniche specifiche che sfruttano sonde a DNA marcate con sostanze radioattive. Il campione di DNA è denaturato quando è ancora immobilizzato nel gel e viene poi esposto a sonde specifiche marcate con elementi radioattivi: in questo modo le sonde si legheranno ai singoli filamenti ad esse complementari così che specifiche sequenze possano essere ritrovate nel gel.

Il risultato dell’elettroforesi di DNA vieneosservato al transilluminatore.