Elettroforesi Bidimensionale SDS-PAGE: Scopri i Segreti, Principi e Applicazioni Essenziali!

L’elettroforesi è una tecnica utilizzata per separare macromolecole cariche. Essa consente quindi la distinzione delle stesse in base alle loro dimensioni o alla carica elettrica che le contraddistingue.

1. Elettroforesi: Cos'è?

L’elettroforesi è una tecnica analitica che consente la separazione in liquido di macromolecole cariche, poste in un campo elettrico, attraverso la migrazione differenziale delle stesse in matrice di agarosio o poliacrilamide. Questa tecnica consente quindi la separazione di proteine e acidi nucleici in base alle dimensioni e/o cariche delle molecole in questione.

Il principio chimico-fisico su cui si basa l’elettroforesi consiste nella risposta che molecole cariche producono se immerse in un campo elettrico: queste, infatti, tenderanno a muoversi lungo le linee del campo di modo che gli ioni positivi migrino verso il polo negativo e quelli negativi verso il polo positivo.

La mobilità delle molecole varia in base alle dimensioni, alle cariche elettriche e alle forme delle molecole, alla differenza di potenziale associata al campo elettrico applicato e alla natura del materiale di cui è composto il gel. Dove Ue è la mobilità elettroforetica, ε la costante dielettrica, ζ il potenziale zeta, f(ka) la funzione di Henry e η la viscosità del solvente.

Mentre la costante dielettrica quantifica la tendenza del materiale a contrastare l’intensità del campo elettrico applicato, il potenziale zeta prende in considerazione le due fasi differenti all’interno della cella elettrolitica: quella liquida nella quale sono presenti le molecole da analizzare e quella solida costituita dai due elettrodi che vengono raggiunti dalle diverse molecole durante la corsa elettroforetica.

Il potenziale zeta, infatti, è la tensione che si genera dalla formazione di un doppio strato elettrico e quindi di un’interfaccia solido-liquido in corrispondenza della quale si instaura un trasferimento di carica.

2. Elettroforesi delle Proteine

L’elettroforesi delle proteine è la tecnica più ampiamente utilizzata in tutti i laboratori di biochimica. Essa è utile per lo studio di soluzioni delle quali si vuole analizzare il contenuto proteico: l’osservazione della migrazione delle diverse molecole, infatti, fornisce uno spettro finale che rispecchia le caratteristiche delle proteine presenti in soluzione.

La caratteristica principale per cui si distingue l’elettroforesi proteica da quella volta all’analisi del DNA sta nella matrice: quella più usata per lo studio dei polipeptidi è la poliacrilamide, da cui deriva il nome PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis, con cui si indica il processo di elettroforesi proteica.

Vengono impaccati due gel con distinte porosità, ottenuti facendo co-polimerizzare acrilamide con metilenbisacrilamide. Il gel di impaccamento, o stacking gel, serve a favorire la concentrazione del campione in una zona molto stretta del gel per migliorare la risoluzione delle bande, prima di entrare nel gel di corsa.

Il gel di corsa, o running gel, è necessario per ottenere la separazione delle proteine.

Visualizzazione delle Tracce Elettroforetiche

Per visualizzare la traccia elettroforetica, infine, si può utilizzare il colorante Coomassie brilliant blue R-250 oppure la tecnica del silver staining. Nel primo caso il gel viene immerso nella soluzione colorante così che si formino interazioni ioniche tra i gruppi solfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine, oltre a interazioni di Van der Waals. L’eccesso di colorante viene eliminato immergendo il gel in una soluzione di etanolo e acido acetico.

Nel secondo caso le proteine sono trattate in modo da diventare sensibili all’argento e poi con un sale dello stesso metallo (in genere nitrato). Una soluzione di sviluppo contenente formaldeide fa precipitare l’argento legato alle proteine riducendo i cationi ad argento metallico. La riduzione viene poi fermata con EDTA.

Tipi di Elettroforesi Proteica

Esistono vari tipi di elettroforesi di proteine. E’ possibile separare le proteine in condizioni native sulla base delle dimensioni e della carica (elettroforesi nativa), per punto isoelettrico (isoelettroforesi), oppure solamente in base alle loro dimensioni (SDS-PAGE).

In ogni caso bisogna considerare che la velocità di migrazione sarà sempre direttamente proporzionale al campo elettrico applicato e alla carica della molecola, mentre risulterà inversamente proporzionale alla viscosità del mezzo e alle dimensioni della molecola (massa molecolare e forma).

Altro tipo di elettroforesi proteica è quella capillare: sono utilizzati tubi sottili e stretti di diametro interno compreso fra i 20 e i 100 micron, di modo che il calore possa essere velocemente dissipato per poter usare campi elettrici molto alti con la contemporanea riduzione dei tempi di separazione ad alcuni minuti.

3. SDS-PAGE: Elettroforesi su Gel di Poliacrilammide in Presenza di Sodio Dodecil Solfato

L’elettroforesi SDS-PAGE consiste in un tipo di corsa elettroforetica in cui le molecole proteiche vengono distinte esclusivamente in base alla loro massa. Il nome di questo tipo di tecnica ci indica il suo principale componente: il sodio dodecil-solfato (SDS). L’SDS è un tensioattivo che in presenza di proteine ne rompe i legami non-covalenti denaturandole e quindi privandole della loro forma originaria.

Al campione viene aggiunto, inoltre, beta-mercapto-etanolo, che agisce da secondo denaturante rompendo i ponti disolfuro della proteina, e somministrato calore. L’estremità anionica della molecola di SDS lega i residui amminoacidici della proteina impartendo ad essa una notevole carica negativa. In questo modo alle proteine denaturate si impartisce una carica che possa uniformarle tutte.

Sappiamo che, dati specifici valori di campo elettrico e di viscosità del mezzo, a parità di carica, migrerà più velocemente la molecola di raggio minore: per questo spesso viene scelta la SDS-PAGE, poiché permette di confrontare le proteine esclusivamente per quella che è la loro massa.

Una volta terminato il processo di elettroforesi il gel di poliacrilamide viene posto all’interno di una soluzione di colorante, in questo caso di Coomassie brilliant blue R-250.

4. Isoelettroforesi (IEF)

L’isoelettroforesi, o isoelettrofocalizzazione (IEF), oppure ancora focalizzazione isoelettrica, sfrutta il punto isoelettrico caratteristico di ciascuna proteina per distinguere le molecole nella loro corsa sulla matrice di gel. Il punto isoelettrico di una molecola corrisponde a quel valore di pH per cui, se in elettroforesi, la molecola smette di migrare e si ferma.

Considerando che una proteina, essendo costituita da amminoacidi, e quindi da potenziali zwitterioni, possiede entrambe le polarità, ciascun polipeptide ha un suo proprio punto isoelettrico (pI) in corrispondenza del quale si ferma in elettroforesi.

Se si sottopone una miscela di proteine a elettroforesi attraverso una soluzione o un gel con un gradiente stabile di pH, in cui il pH aumenta in modo regolare dall’anodo al catodo, ciascuna proteina migrerà fino alla posizione corrispondente al suo pI.

5. Elettroforesi Bidimensionale (2D-PAGE)

Il campione è prima sottoposto a IEF in una direzione, quindi le molecole proteiche vengono distinte mediante SDS-PAGE nella direzione perpendicolare. L’elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE) combina due tecniche di separazione: la focalizzazione isoelettrica, che separa le proteine in base al loro punto isoelettrico, e l’SDS-PAGE.

6. Elettroforesi Nativa vs. Denaturante

Come scegliere fra un’elettroforesi denaturante e una nativa? Una elettroforesi nativa potrebbe dare risultati ingannevoli a causa della forma della molecola, perciò in genere si preferiscono quelle denaturanti.

Tuttavia, consente di preservare l’attività biologica della proteina, di identificare la posizione della proteina nel gel mediante specifici saggi funzionali e di recuperarla in forma attiva, ed è indicata per evidenziare la contemporanea presenza di forme monomeriche e oligomeriche di una specie proteica pura.

Bisogna però considerare che non si può conoscere a priori la mobilità elettroforetica della proteina, né ne si possono identificare le dimensioni, quindi il risultato resta poco affidabile.

7. Elettroforesi degli Acidi Nucleici

L’elettroforesi degli acidi nucleici viene principalmente utilizzata per l’analisi di frammenti di DNA. Questa segue gli stessi principi elettrochimici dell’elettroforesi proteica anche se prevede metodiche leggermente differenti.

La prima differenza fra un’elettroforesi proteica e una svolta sugli acidi nucleici sta nel fatto che le molecole in questione nel secondo caso sono sempre cariche negativamente. Data la struttura di base di DNA e RNA, infatti, essendo i nucleotidi composti da una molecola di ribosio, una base azotata e un fosfato, le molecole sono necessariamente a carica fortemente negativa.

Inoltre, in questo tipo di elettroforesi varia la matrice: non si parla più di poliacrilamide ma di gel di agarosio, un polimero polisaccaride purificato dall’agar-agar, sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle alghe rosse.

Altra differenza sta nella posizione della cella elettrolitica: se nel caso dell’elettroforesi proteica il gel di acrilamide viene posto verticalmente, nel caso si analizzino acidi nucleici il gel di agarosio si dispone orizzontalmente.

Nel caso di elettroforesi di DNA, inoltre, si utilizzano enzimi di restrizione e quindi proteine appartenenti alla classe delle idrolasi: si tratta di deossiribonucleasi II sito-specifiche. Questi enzimi sono capaci di frammentare il doppio filamento del DNA agendo in modo da tagliare entrambi i filamenti ad una stessa altezza. In questo modo il genoma viene degradato in sezioni di tutte le grandezze e può poi così essere analizzato in elettroforesi.

Visualizzazione del DNA

Per quanto riguarda la visualizzazione dello spettro elettroforetico finale, nel caso degli acidi nucleici non si utilizzano coloranti semplici come nel caso delle proteine, bensì composti che in genere risultano agenti intercalanti per il genoma stesso. Il più utilizzato è il bromuro di etidio.

Questa molecola, completamente planare, possiede atomi tutti ibridizzati sp2 grazie ai doppi legami coniugati che li uniscono. Si presenta così di spessore paragonabile a quello delle basi azotate fra le quali può incunearsi (intercalare): una volta che il bromuro di etidio intercala, la fluorescenza della sezione di DNA se illuminato da raggi UV aumenta di circa 100 volte.

L’elettroforesi degli acidi nucleici utilizza una matrice diversa che si compone di gel di agarosio. L’elettroforesi su gel di agarosio è utile per analizzare la grandezza dei singoli frammenti di DNA e per andare a valutare la presenza di specifiche sequenze di DNA.

Per analizzare la dimensione dei frammenti si utilizza una soluzione, da inserire nel primo pozzetto, contenente frammenti DNA di dimensioni note. In questo modo confrontando il percorso svolto da questi frammenti con quelli presenti negli altri pozzetti si potranno osservare le effettive dimensioni degli stessi.

Per quanto riguarda la presenza di specifiche sequenze di DNA, invece, si utilizzano tecniche specifiche che sfruttano sonde a DNA marcate con sostanze radioattive. Il campione di DNA è denaturato quando è ancora immobilizzato nel gel e viene poi esposto a sonde specifiche marcate con elementi radioattivi: in questo modo le sonde si legheranno ai singoli filamenti ad esse complementari così che specifiche sequenze possano essere ritrovate nel gel.

Il risultato dell’elettroforesi di DNA viene osservato al transilluminatore.

8. Applicazioni dell'Elettroforesi delle Proteine

L’elettroforesi delle proteine è una tecnica fondamentale utilizzata in biologia molecolare e biochimica per separare le proteine in base alla loro dimensione e carica elettrica. Questa metodologia è cruciale per l’analisi della composizione proteica di campioni biologici, permettendo di identificare e quantificare specifiche proteine.

L’elettroforesi delle proteine è una tecnica analitica che sfrutta il principio della migrazione delle molecole cariche in un campo elettrico. Le proteine, essendo molecole cariche, si muovono attraverso un gel sotto l’influenza di un campo elettrico. Questa tecnica è essenziale per l’analisi delle proteine in campioni complessi, come quelli derivati da tessuti o fluidi biologici.

L’elettroforesi delle proteine è utilizzata anche per monitorare la purezza delle proteine durante i processi di purificazione. Inoltre, l’elettroforesi delle proteine è uno strumento diagnostico prezioso.

9. Principi Fondamentali

Il principio fondamentale dell’elettroforesi delle proteine è la migrazione delle molecole cariche in un campo elettrico. Quando viene applicato un campo elettrico, le proteine si muovono verso l’elettrodo di carica opposta. Il gel utilizzato nell’elettroforesi delle proteine è solitamente composto da poliacrilammide, un materiale che forma una matrice porosa.

Un altro principio chiave è l’uso di tamponi specifici che mantengono il pH costante durante l’elettroforesi.

10. Tipi di Elettroforesi delle Proteine

Esistono diversi tipi di elettroforesi delle proteine, ognuno con specifiche applicazioni e vantaggi. Un altro tipo è l’elettroforesi su gel in condizioni native, che separa le proteine in base alla loro carica e dimensione senza denaturarle. Infine, l’elettroforesi capillare è una tecnica avanzata che utilizza capillari sottili per separare le proteine con alta efficienza e velocità.

11. Preparazione del Campione

La preparazione del campione è un passaggio critico nell’elettroforesi delle proteine. I campioni devono essere trattati con cura per evitare la degradazione delle proteine e per garantire una separazione accurata. L’SDS è un detergente anionico che denatura le proteine, conferendo loro una carica negativa uniforme. Il DTT è un agente riducente che rompe i ponti disolfuro nelle proteine, contribuendo ulteriormente alla denaturazione.

Oltre ai reagenti per la preparazione del campione, sono necessari tamponi specifici per l’elettroforesi. Questi tamponi garantiscono che il pH rimanga costante durante l’esperimento, permettendo una migrazione uniforme delle proteine.

12. Procedura di Elettroforesi

La procedura di elettroforesi delle proteine inizia con la preparazione del gel di poliacrilammide. Il gel viene colato in un’apposita cassetta e lasciato polimerizzare. I campioni di proteine, precedentemente preparati e denaturati, vengono caricati nei pozzetti del gel insieme ai marker di peso molecolare.

Durante la corsa elettroforetica, le proteine si separano in base alla loro dimensione, con le proteine più piccole che migrano più velocemente. Al termine della corsa, il gel viene rimosso dall’apparato e sottoposto a colorazione per visualizzare le proteine separate. La colorazione più comune è quella con blu di Coomassie, che lega le proteine e le rende visibili come bande sul gel.

13. Analisi dei Risultati

L’analisi dei risultati dell’elettroforesi delle proteine inizia con l’osservazione delle bande sul gel. Ogni banda rappresenta una proteina o un gruppo di proteine con dimensioni simili. L’intensità delle bande può essere quantificata utilizzando software di analisi dell’immagine, che permette di ottenere informazioni sulla quantità relativa di ciascuna proteina nel campione.

L’interpretazione dei risultati richiede una buona conoscenza delle proteine in esame e delle condizioni sperimentali. Ad esempio, la presenza di bande multiple può indicare la presenza di isoforme proteiche o di proteine degradate.