Scopri Tutto sull'Anello Porfirinico e l'Emoglobina: Struttura, Funzione e Segreti Sorprendenti!

Un principio conduttore che aiuta a sintetizzare la grande quantità di materiale accumulato negli ultimi anni sull'emoglobina è la sua struttura e funzione.

Struttura dell'Emoglobina

Le emoglobine contengono due paia di catene polipeptidiche differenti: le subunità α, che sono costituite da 141 residui di amminoacidi, e le subunità non-α (cioè le catene β dell'HbA, le catene γ dell'HbF e le catene δ dell'HbA2), che sono composte da 146 residui; la sequenza degli amminoacidi (struttura primaria) delle catene α, β, e δ di emoglobine provenienti da numerose specie animali è ora completamente nota.

Un confronto fra le strutture primarie delle differenti subunità mostra che solo sei posizioni, su un totale di circa 140, sono sempre occupate dallo stesso amminoacido. A questi residui invarianti che, con un paio di eccezioni, si trovano nel ripiegamento proteico che contiene il gruppo eme e nella zona di contatto fra le subunità, è stato attribuito un ruolo molto importante nel determinare le proprietà strutturali e funzionali dell'emoglobina. La conoscenza dettagliata della struttura tridimensionale di questa proteina è in gran parte basata su studi cristallografici.

Le caratteristiche generali sono simili per le quattro catene polipeptidiche:

la maggior parte degli amminoacidi, sia delle subunità α che β, è disposta in regioni elicoidali; ciascuna catena contiene otto (subunità β) o sette (subunità α) di queste regioni, ripiegate una sull'altra e unite da brevi zone non-elicoidali, così da assumere una forma approssimativamente sferica;
la struttura tridimensionale delle subunità è tenuta insieme da legami deboli non-covalenti, come ponti salini, interazioni a idrogeno e molte interazioni non-polari;
i residui degli amminoacidi polari si trovano per lo più esposti al solvente, mentre i residui non-polari giacciono nell'interno della molecola o nelle regioni di contatto fra le subunità.

Le quattro catene sono unite fra loro in modo da formare un tetraedro irregolare con i gruppi eme ai quattro vertici. Il ripiegamento proteico, dove sono parzialmente incassati gli emi, è costituito, oltre che da due istidine apparentemente essenziali, da residui idrofobici che sono a contatto con le catene laterali dell'anello porfirinico.

Una delle istidine, detta prossimale, coordina direttamente il ferro eminico ed è presente in tutte le emoglobine capaci di combinarsi reversibilmente con l'ossigeno; questo gas si lega all'atomo di ferro sul lato dell'eme opposto alla istidina prossimale. Il secondo residuo di istidina, detta distale, non è legato all'atomo di ferro, ma giace, rispetto al piano dell'eme, dallo stesso lato dell'ossigeno ed è situato in modo da poter interagire con i leganti.

La natura idrofobica del sito dell'eme è della massima importanza per la stabilità del complesso con l'ossigeno. Il ferroeme isolato, infatti, è instabile in soluzione acquosa ed è rapidamente ossidato a ferrieme, che non può combinarsi con l'ossigeno; quando però viene legato all'imidazolo e il complesso che ne deriva è immobilizzato in un film di polistirene, in modo da essere circondato da un ambiente idrofobico, si ha l'ossigenazione reversibile del sistema, analoga a quella dell'emoglobina e cioè senza ossidazione dell'atomo di ferro.

La relazione fra ciascuna catena e le altre due di tipo diverso non è identica. Così il numero di punti di contatto fra le subunità α1 e β1 (34 residui di amminoacidi) è maggiore di quello fra le subunità α1 e β2 (19 residui di amminoacidi). Le conformazioni di ciascuna catena polipeptidica mostrano differenze significative nello stato ossigenato e in quello desossigenato della molecola. L'atomo di ferro è coplanare all'anello porfirinico del gruppo eme nell'ossiemoglobina, mentre nella desossiemoglobina esso giace fuori del piano di circa 0,6 Å.

È stato ipotizzato che il movimento dell'atomo di ferro, che avviene con l'ossigenazione, dia l'avvio a variazioni conformazionali della parte proteica, trasportando con sé il segmento polipeptidico a cui appartiene l'istidina prossimale. Le estremità carbossiliche di ciascuna catena polipeptidica, che si trovano in vicinanza dei gruppi eme, sono libere di ruotare nell'ossiemoglobina, mentre sono immobilizzate nella configurazione desossigenata; queste differenze strutturali coinvolgono variazioni nelle interazioni elettrostatiche (ponti salini) di gruppi ionizzabili che giocano un ruolo importante nei meccanismi molecolari dell'emoglobina.

Le quattro subunità delimitano una cavità centrale che attraversa la molecola lungo l'asse binario del tetramero; questa cavità, ripiena di acqua, è tappezzata da numerosi residui di amminoacidi polari. La posizione relativa delle catene polipeptidiche cambia con l'ossigenazione e l'effetto globale di questa variazione conformazionale è quello di lasciare le subunità α nella medesima posizione relativa e di aumentare la separazione delle subunità β.

Dissociazione in subunità

La molecola dell'emoglobina in soluzione è in equilibrio di associazione-dissociazione con le sue subunità. Le condizioni che facilitano questa dissociazione sono: bassi valori di pH o, più esattamente, la presenza di acidi carbossilici indissociati, alti valori di pH e alte concentrazioni di sali.

La reazione di mercuriali con i sei gruppi sulfidrilici dell'emoglobina induce una maggiore dissociazione che coinvolge anche le singole catene polipeptidiche. In queste ultime condizioni è possibile separare, con elettroforesi o cromatografia, la subunità α dalle β, in uno stato nativo, cioè possono essere isolate le subunità in grado di reagire reversibilmente con l'ossigeno.

Origine dei fenomeni cooperativi ed effetti allosterici

La forma sigmoide della curva di equilibrio dell'emoglobina con i leganti riflette un aumento di affinità man mano che aumenta il grado di saturazione; in altre parole, la combinazione successiva delle quattro molecole di ossigeno con ciascuna molecola di emoglobina è resa sempre più facile. Questo fenomeno d'interazione cooperativa (la cosiddetta interazione tra gli emi) dipende appunto dalle variazioni conformazionali indotte dal legame dell'ossigeno.

Forse l'aspetto più importante per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base del trasporto dei gas respiratori è la scoperta che l'emoglobina può esistere in almeno due conformazioni ben distinte, corrispondenti allo stato desossigenato (conformazione a bassa affinità per i leganti allo stato T nella terminologia dei modelli allosterici) e allo stato ossigenato (conformazione ad alta affinità per i leganti o forma R). Queste conformazioni, che in soluzione sono in equilibrio termodinamico, si differenziano tra loro, come già detto, nella posizione di residui laterali delle singole catene polipeptidiche e specialmente nella posizione relativa delle subunità.

La differenza di struttura tra l'emoglobina ossigenata e quella desossigenata è considerata la base fisica della cooperatività nei vari modelli proposti per descrivere i fenomeni d'interazione che dominano le reazioni di questa proteina. La combinazione dei leganti con la forma desossigenata dell'emoglobina induce variazioni della struttura terziaria delle singole subunità che si legano con l'ossigeno; ciò conduce a una progressiva rottura dei ponti salini fra le estremità carbossiliche, che a un certo punto determina la transizione dalla struttura quaternaria T, a bassa affinità per i leganti, a quella R, ad alta affinità.

In realtà l'esistenza di due soli tipi di strutture, T ed R, dell'emoglobina è sufficiente a spiegare molte sue caratteristiche funzionali. Sembra però che l'emoglobina.

Effetto del solvente sull'equilibrio con l'ossigeno

Sebbene sia noto da tempo che la composizione del solvente (cioè la concentrazione e il tipo di soluti, oltre la proteina) influenzi le proprietà funzionali dell'emoglobina, solo recentemente si è giunti all'identificazione dei gruppi atomici sulla parte proteica coinvolti nell'interazione con le molecole del solvente. Inoltre è stato chiarito che alcuni soluti rivestono un importante significato fisiologico a livello molecolare; in particolare l'effetto del 2,3-disfofoglicerato (DPG) sull'affinità per i leganti ha assunto un preciso significato fisiologico, accoppiando il trasporto dell'ossigeno ai processi metabolici intraeritrocitari.

Il DPG si lega all'emoglobina in un rapporto di uno per tetramero. L'affinità per la forma desossigenata, a bassa forza ionica, è molto alta (circa 104-106M-1), mentre quella per la forma ossigenata è da 1 a 2 ordini di grandezza più piccola; in condizioni fisiologiche, l'interazione con l'ossiemoglobina è tuttavia trascurabile.

La diminuzione dell'affinità per l'ossigeno, determinata dalla presenza di fosfati organici nel solvente, implica che la desossiemoglobina ha una maggiore affinità della forma ossigenata per queste molecole. La formazione del complesso del DPG con la desossiemoglobina infatti è accompagnata da una variazione di energia libera (circa −6,5 kcal/mole), che determina appunto la stabilizzazione della conformazione desossigenata responsabile della resistenza all'ossigenazione che l'emoglobina mostra in presenza di questo cofattore.

Studi di diffrazione dei raggi X hanno permesso l'identificazione del sito dove il DPG si lega alla desossiemoglobina: esso si trova nella cavità centrale della proteina e coinvolge numerosi gruppi caricati positivamente che formano ponti salini con le cariche negative del DPG. La conformazione del sito di legame è distorta con l'ossigenazione e la perdita della complementarietà della distribuzione delle cariche elettriche spiega la ridotta affinità dei fosfati organici per l'ossiemoglobina: il medesimo effetto del DPG può essere riprodotto anche con molti anioni inorganici, come i cloruri e i fosfati; solo il DPG è però capace di esercitare la sua influenza a concentrazioni (5 mM) compatibili con l'equilibrio osmotico dell'eritrocita.

I protoni costituiscono un altro importante componente del solvente che modifica l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno (effetto Bohr). L'effetto Bohr alcalino è una conseguenza del fatto che la conformazione desossigenata si combina con i protoni più facilmente di quella ossigenata; poiché nei tessuti, come risultato dei processi metabolici, si ha una maggiore concentrazione di protoni, l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno diminuisce ed è così facilitata la liberazione di questo gas.

I gruppi atomici responsabili dell'effetto Bohr sono pochi e fra essi sono stati identificati la valina, che si trova in posizione amminica-terminale nelle subunità α, e l'istidina, situata all'estremità carbossilica delle subunità β. La forza acida di questi gruppi è normale nell'ossiemoglobina, dove sono liberi di muoversi a contatto con il solvente, mentre nella deossiemoglobina la loro forza acida diminuisce, poiché la forma protonata è stabilizzata da ponti salini.

È ben noto che l'anidride carbonica, disciolta nel solvente, influenza l'affinità dell'emoglobina. È stato ora chiarito che una frazione significativa di anidride carbonica (circa il 15% del totale) si combina direttamente all'emoglobina. Poiché la formazione di carbammati è più pronunciata con la desossiemoglobina che con il derivato ossigenato, l'anidride carbonica legata in questa maniera fa diminuire l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno con il medesimo meccanismo del DPG e dei protoni, favorendo cioè la conformazione desossigenata.

Il trasporto dell'ossigeno da parte dell'emoglobina è così sotto il controllo di almeno questi tre cofattori: DPG, protoni e anidride carbonica.

Emoglobine anormali

Anormali sono definite le emoglobine caratterizzate da un'alterazione della parte proteica della molecola. Sono state scoperte circa 200 varianti dell'emoglobina umana e si conosce anche il tipo e la posizione dell'amminoacido coinvolto; di esse oltre 30 mostrano proprietà funzionali anormali.

Tra emoglobina e mioglobina ci sono stringenti relazioni di parentela: entrambe sono proteine coniugate ed il loro gruppo prostetico (parte non proteica) è il gruppo eme. La mioglobina è una proteina globulare costituita da una singola catena di circa centocinquanta amminoacidi (dipende dall'organismo) ed il suo peso molecolare è di circa 18 Kd. L'eme è un anello tetrapirrolico (protoporfirina): presenta quattro anelli pirrolici tenuti insieme da gruppi metilenici (-CH=); a completare la struttura ci sono due gruppi vinilici (CH2=CH-), quattro gruppi metilici (-CH3) e due propionici (-CH2-CH2-COO-).

Il legame tra protoporfirina e ferro è un legame tipico dei composti detti di coordinazione che sono composti chimici in cui un atomo (o ione) centrale, forma dei legami con altre specie chimiche in numero superiore al suo numero di ossidazione (carica elettrica). Il numero di coordinazione (numero di legami di coordinazione) del ferro è sei: ci possono essere sei molecole attorno al ferro che mettono in condivisione gli elettroni di legame. Quando il ferro è sotto forma di ione libero, i suoi orbitali di tipo d hanno tutti la stessa energia; nella mioglobina, lo ione ferro è legato alla protoporfirina e all'istidina: tali specie perturbano magneticamente gli orbitali d del ferro; l'entità della perturbazione sarà diversa per i vari orbitali d a seconda della loro orientazione spaziale e di quella delle specie perturbanti.

La Mioglobina è una proteina presente nei muscoli, la cui funzione è proprio quella di "serbatoio" di ossigeno. L'emoglobina è un tetrametro cioè è costituita da quattro catene polipeptidiche ciascuna dotata di un gruppo eme ed identiche a due a due (in un essere umano si hanno due catene alfa e due catene beta). La funzione principale dell'emoglobina è il trasporto di ossigeno; un'altra funzione del sangue in cui è coinvolta l'emoglobina, è il trasporto di sostanze ai tessuti.

Una spiegazione della presenza di più catene diverse è la seguente: nel corso del processo evolutivo degli organismi, anche l'emoglobina si è evoluta specializzandosi nel trasporto di ossigeno da zone che ne sono ricche a zone carenti. La mioglobina, lega l'ossigeno anche a pressioni modeste; nei tessuti periferici si ha una pressione (PO2) di circa 30 mmHg: la mioglobina a tale pressione non rilascia ossigeno, quindi sarebbe inefficace come trasportatrice di ossigeno. L'emoglobina, invece, ha un comportamento più elastico: lega l'ossigeno ad alte pressioni e lo rilascia quando la pressione diminuisce.

Quando una proteina è funzionalmente attiva, essa può mutare un po' la sua forma; ad esempio la mioglobina ossigenata ha una forma diversa dalla mioglobina non ossigenata e questa mutazione non influisce su quelle vicine. Il discorso è diverso nel caso di proteine associate come l'emoglobina: quando una catena si ossigena è indotta a cambiare la sua forma ma tale modificazione è tridimensionale perciò ne risentono anche le altre catene del tetrametro. Il fatto che le catene siano tra loro associate, induce a pensare che la modifica di una si ripercuota sulle altre vicine anche se in misura diversa; quando una catena si ossigena, le altre catene del tetrametro assumono un "atteggiamento meno ostile" nei riguardi dell'ossigeno: la difficoltà con cui una catena si ossigena diminuisce man mano che le catene ad essa vicine si ossigenano a loro volta.

La struttura quaternaria della deossiemoglobina prende il nome di forma T (tesa) mentre quella della ossiemoglobina viene chiamata forma R (rilasciata); nello stato teso vi sono una serie di interazioni elettrostatiche piuttosto forti tra amminoacidi acidi e amminoacidi basici che portano ad una struttura rigida della deossiemoglobina (ecco il perché del "forma tesa"), mentre quando si lega l'ossigeno, l'entità di queste interazioni diminuisce (ecco il perché del "forma rilasciata").

Inoltre, in assenza di ossigeno, la carica dell'istidina (vedi struttura) viene stabilizzata dalla carica opposta dell'acido aspartico mentre, in presenza di ossigeno, c'è la tendenza da parte della proteina, a perdere un protone; tutto ciò comporta che l'emoglobina ossigenata sia un acido più forte dell'emoglobia deossigenata: effetto bohr. Ogni emoglobina rilascia 0,7 protoni per mole di ossigeno (O2) entrante.

Vediamo l'effetto della temperatura. A pH fisiologico, il 2,3 bisfosfoglicerato è deprotonato ed ha su di sé cinque cariche negative; si va ad incuneare tra le due catene beta dell'emoglobina perché tali catene presentano un'elevata concentrazione di cariche positive. Un altro fenomeno che si verifica quando un eritrocita raggiunge un tessuto è il seguente: per gradiente, l'HCO3- (derivato dell'anidride carbonica) esce dall'eritrocita e, per bilanciare l'uscita di una carica negativa, si ha l'ingresso di cloruri che determina un aumento della pressione osmotica: per bilanciare questa variazione si verifica anche l'ingresso di acqua che causa un rigonfiamento dell'eritrocita (effetto HAMBURGER). Il fenomeno opposto si verifica quando un eritrocita raggiunge gli alveoli polmonari: si ha uno sgonfiamento degli eritrociti (effetto HALDANE).

L'ossigeno, essendo poco solubile in acqua, non può essere trasportato a livello dei tessuti nel plasma sanguigno. Per questo è necessario che l'ossigeno si leghi a qualche molecola nel torrente circolatorio. Invece, il ferro in forma ionica e precisamente nello stato di ossidazione +2, è meno reattivo del ferro metallico. Il sangue contiene i globuli rossi o eritrociti, i quali contengono l'emoglobina e quindi trasportano e rilasciano l'ossigeno.

Durante il processo di maturazione a partire da cellule staminali, gli emocitoblasti, vengono prodotte le cellule figlie, che producono grandi quantità di emoglobina e perdono gli organelli citoplasmatici, come i mitocondri e il nucleo. L'emoglobina è costituita da 4 subunità. Struttura dell'emoglobina: le quattro subunità che la costituiscono sono rappresentate due in blu e due in rosso. L'emoglobina A è quella tipica degli adulti e contiene due tipi di globine, quindi le 4 subunità sono due catene α, costituite ognuna da 141 amminoacidi, e due catene β, costituite ognuna da 146 amminoacidi. La struttura tridimensionale di queste due subunità è simile a quella della mioglobina, che pure varia in quanto a struttura primaria. L'interfaccia tra le subunità α1 e β1 e quella tra α2 e β2 sono costituite ognuna da circa 30 residui amminoacidici ed è abbastanza forte.

Dall'analisi ai raggi X, è stato possibile vedere che l'emoglobina è presente in due conformazioni: lo Stato R (rilassato) e lo Stato T (teso). In questo modo essa subisce una modificazione conformazionale che influenza anche le subunità adiacenti, facilitando quindi l'interazione delle altre subunità con l'ossigeno. Quindi, l'emoglobina è una proteina allosterica. Il legame cooperativo dell'ossigeno all'emoglobina venne scoperto nel 1910 da Hill.

L'anidride carbonica prodotta dalla respirazione mitocondriale in seguito all'ossidazione delle molecole organiche, subisce reazione di idratazione, formando in maniera reversibile protoni e ioni bicarbonato. Questa reazione è catalizzata dall'enzima anidrasi carbonica, presente in grandi quantità nei globuli rossi. L'anidride carbonica è poco solubile in acqua e quindi deve essere convertita in bicarbonato (HCO3−). Nei polmoni, invece, l'anidride carbonica viene espulsa e, quindi, si trova presente in scarsa quantità.

La funzione dell'emoglobina è regolata anche dal 2,3-bisfosfoglicerato (BPG), il quale è presente in alte concentrazioni nei globuli rossi. L'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno è minore quando la concentrazione di BPG aumenta. Invece, ad alta quota, la pressione di ossigeno è molto più bassa e il trasferimento di ossigeno ai tessuti si riduce. I feti hanno un'emoglobina differente. Al posto delle subunità β, sono presenti subunità γ. L'emoglobina fetale, che ha un'affinità molto bassa per il BPG, presenta un'elevata affinità per l'ossigeno.

Sono note almeno 500 varianti genetiche dell'emoglobina umana, di cui alcune molto rare. Molte differiscono per un solo amminoacido, quindi subiscono mutazioni puntiformi. L'anemia falciforme colpisce soggetti che ereditano l'allele dell'emoglobina a cellule falciformi da entrambi i genitori. L'emoglobina normale, chiamata emoglobina A, è molto più solubile di questo tipo di emoglobina, l'emoglobina S. L'emoglobina S contiene un residuo di valina anziché un residuo di glutammato nelle due catene β. La valina non ha la carica elettrica negativa che possiede il glutammato in catena laterale, quindi forma un'interazione idrofobica, che porta a un'anomalia strutturale della proteina.

Chi soffre di anemia falciforme presenta i seguenti sintomi: debolezza, respiro corto, problemi cardiaci, tachicardia e anche stati confusionali. Essi presentano solo la metà di emoglobina normale perché le cellule sono fragili e si rompono facilmente. La malaria è causata dal parassita protozoo Plasmodium, che, inoculato dalla puntura della zanzara Anopheles, penetra nei globuli rossi più piccoli, spessi e deformati. Quindi la selezione naturale ha portato alla diffusione di una popolazione anemica. Valori di emoglobina al di sotto di queste soglie sono correlati prevalentemente ad anemia, carenza di ferro o gravidanza. Meno frequentemente, bassi livelli di emoglobina sono indice di patologie tumorali, come la leucemia, o di avvelenamento da piombo.

Le porfirine sono una interessante classe di composti, molto importanti dal punto di vista biologico, formalmente derivati dall'unione di quattro unità di pirrolo, unite fra loro nelle posizioni α per mezzo di ponti -CH= (metino). La caratteristica più rilevante delle porfirine è la facilità con cui esse formano dei chelati con molti ioni metallici in cui il metallo viene tenuto saldamente nello spazio mediante i quattro atomi di azoto del sistema planare.

Al centro dell'anello della porfina si può sistemare infatti, in maniera energicamente molto stabile, un atomo di metallo che si lega ai quattro atomi di azoto con due legami covalenti, sostituendo i due atomi di idrogeno e formando con gli altri due azoti due legami di coordinazione; a causa poi del fenomeno della risonanza, i quattro legami sono perfettamente equivalenti e si forma in tal modo un complesso chelato molto stabile. Le porfirine sono molto colorate: il sistema fondamentale è rosso-arancio, ma il colore di ogni composto singolo dipende anche dai sostituenti che porta e dalla natura dell'atomo centrale di metallo, se è presente.

La funzione dell'emoglobina nel sangue è quella di trasportare l'ossigeno ai tessuti; è costituita da una porzione proteica chiamata globina ed un complesso ferro/porfirina chiamato gruppo eme. L'atomo di ferro nell'eme è nello stato di ossidazione ferroso.

Tabella riassuntiva

Componente	Funzione	Struttura
Emoglobina	Trasporto di ossigeno nel sangue	Tetramero con 4 subunità (2α e 2β), ciascuna con un gruppo eme
Mioglobina	Riserva di ossigeno nei muscoli	Singola catena polipeptidica con un gruppo eme
Gruppo Eme	Legame reversibile con l'ossigeno	Anello porfirinico con un atomo di ferro al centro
2,3-DPG	Regolazione dell'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno	Molecola che si lega alla desossiemoglobina, riducendo l'affinità per l'ossigeno