Amniocentesi Molecolare: Scopri Cosa Rileva e Perché è Rivoluzionaria!

L'amniocentesi è l’esame diagnostico prenatale invasivo più antico, cui oggi si può ancora ricorrere al fine di accertare o escludere la presenza di anomalie cromosomiche fetali, in termini di numero e di struttura dei cromosomi. L’esame si esegue in genere tra la 15ª e la 17ª settimana di gestazione e consiste nel prelievo, mediante guida ecografica, di una piccola quantità di liquido amniotico, in cui è immerso il feto.

Il prelievo, che dura circa un minuto, viene effettuato introducendo un ago nell’addome materno con il quale si attraversano la parete dell’utero e le membrane amniotiche fino a raggiungere il sacco amniotico. Il liquido amniotico prelevato, la cui quantità è irrilevante per il benessere fetale, viene poi trattato e coltivato in laboratorio per poter studiare il cariotipo del feto, ovvero l’intero corredo cromosomico.

Anomalie Cromosomiche Rilevabili

Le anomalie cromosomiche sono alterazioni del numero o della struttura dei cromosomi. Le anomalie numeriche dei cromosomi, che vengono chiamate anche aneuploidie, sono caratterizzate da un numero maggiore o inferiore di cromosomi rispetto al numero standard. Si parla, ad esempio, di trisomia, quando si riscontra la presenza di un cromosoma in più.

A questo gruppo di anomalie cromosomiche appartengono patologie note come Sindrome di Down o Trisomia 21, dove l’individuo presenta 47 cromosomi, ovvero possiede una copia in più del cromosoma 21. La trisomia 13, invece, prende il nome di Sindrome di Patau, mentre la trisomia 18, Sindrome di Edwards. Si parla, invece, di monosomia, quando si riscontra l’assenza di un cromosoma.

Per quanto riguarda i cromosomi sessuali, X ed Y, la situazione è diversa. Infatti in questi casi l’aberrazione non è una vera e propria trisomia bensì la perdita o l’aggiunta di uno dei due cromosomi rispetto all’assetto normale XX che caratterizza il sesso femminile od XY proprio di quello maschile.

Tra le aneuploidie, le trisomie 21, 18, 13 e le aneuplidie dei cromosomi sessuali (es. monosomia X), comprendono circa l’80%-95% delle possibili anomalie cromosomiche rivelabili tramite la determinazione del cariotipo. Tali anomalie cromosomiche sono senz’altro quelle maggiormente responsabili di malformazioni fetali che portano a gran parte degli aborti precoci ossia durante il primo trimestre di gravidanza.

In alcuni casi le gravidanze con feti affetti da trisomia 21, 18 e 13 possono procedere nel corso dell’età gestazionale e portare alla nascita di neonati affetti dalla relativa patologia cromosomica (probabilità di sopravvivenza alla nascita rispettivamente del 22,1%, 5,4% e 2,8%). Il meccanismo principale con cui si producono le aneuploidie è costituito dalla non-disgiunzione, ovvero dalla mancata separazione dei cromosomi omologhi o dei cromatidi durante la meiosi nel corso della gametogenesi.

È ormai noto che dell’incidenza di anomalie cromosomiche è direttamente proporzionale all’età materna. In particolare per la sindrome di Down si calcola che oltre i 40 anni una gravidanza su 100 sia interessata da questo tipo di anomalia. Tale fenomeno ha avuto, in questi ultimi anni, un impatto non indifferente a livello etico - sociale in quanto l’età media al primo parto è aumentata in maniera considerevole.

Si pensi infatti che nell’ultimo trentennio, si è passati dai 20-21 anni ai 29-30 attuali. L’approccio tradizionale nella diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche comporta la messa in coltura di cellule fetali ricavate da prelievi di liquido amniotico e la determinazione del cariotipo tramite l’analisi al microscopio dei cromosomi in metafase.

Metodiche di Diagnosi Molecolare

QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR)

Nell’ambito della diagnosi prenatale, oltre ai test genetici già descritti, è sempre più utilizzata una tecnica di diagnostica molecolare che permette diagnosi rapida di alcune aneuploidie fetali (quelle relative ai cromosomi 21, 13, 18, X e Y), conosciuta come amplificazione enzimatica in vitro del DNA fluorescente o QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR). Oggi tal tecnica, che si e’ ormai sostituita completamente alla tecnica di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH), affianca le analisi citogenetiche tradizionali eseguite di routine e dalle quali si differenzia per una maggiore rapidità (risultato disponibile entro entro 24h-48h dal prelievo), per la necessità di una minore quantità di liquido amniotico (1-1,5 ml), 1-2 villi coriali, 0,1 ml di sangue fetale, partendo da DNA estratto da materiale cellulare non coltivato.Il fattore più importante, rispetto alle tecniche tradizionali, è legato alla possibilità di eseguire test di laboratorio precisi, affidabili e soprattutto rapidi partendo da una minima quantità di materiale, a volte anche da poche cellule.

La verifica in termini qualitativi e quantitativi della segregazione degli alleli parentali mediante QF-PCR e corsa elettroforetica fluorescente dei prodotti di amplificazione permette di poter evidenziare nel feto la presenta di eventuali trisomie. Pattern allelico non informativo: presenza di un solo picco fluorescente per ogni locus polimorfico testato.

Per quanto riguarda i cromosomi sessuali viene impiegata una sequenza relativa al gene dell’amelogenina. In questo caso un campione che presenta 1 picco nell’amelogenina ed 1 o 2 picchi nel DXS8377 indica un assetto cromosomico femminile normale (XX); mentre un campione con 2 picchi di differente dimensione a livello dell’amelogenina ed 1 picco nel DXS8377 un assetto cromosomico maschile normale (XY).

L’applicazione della tecnica QF-PCR in epoca prenatale per il riconoscimento di alcune anomalie cromosomiche di numero, ha alcune limitazioni. Nel caso di QF-PCR positiva per una trisomia, l’esame non permette di distinguere tra una vera trisomia fetale ed un mosaicismo confinato alla placenta (o ad altri tessuti extra fetale) privo di significato patologico per il feto.

Cariotipo Molecolare

Lo studio del cariotipo fetale presenta un’ importanza diagnostica elevatissima perché evidenzia le anomalie cromosomiche più severe e frequenti ( come ad esempio le trisomie ) a carico di tutti i cromosomi, tuttavia, a causa dei limiti di risoluzione della tecnica, piccoli riarrangiamenti cromosomici potrebbero non essere facilmente evidenziabili.

Rispetto all’esame citogenetico tradizionale, l’analisi molecolare dei cromosomi ha una risoluzione molto più elevata (~100 volte). Ciò consente di identificare alcune patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche (microdelezioni e le micro duplicazioni), non evidenziabili tramite il cariotipo tradizionale, aumentando sensibilmente l’accuratezza dell’esame.

Il cariotipo molecolare, infatti, consente di effettuare rapidamente non solo lo studio dell’assetto cromosomico fetale, ma anche di un gruppo di 100 patologie causate da microdelezione / microduplicazione cromosomica (es. Sindrome di Prader-Willi/ Angelman: queste due sindromi coinvolgono lo stesso tratto cromosomico (regione critica 15q11.2-q13), ma presentano manifestazioni differenti a seconda se il cromosoma interessato è di origine materna o paterna.

La sindrome di Prader-Willi è una condizione caratterizzata principalmente da bassa statura, obesità, ipotonia muscolare, alterazioni endocrinologiche, dismorfismi del volto e ritardo di sviluppo psicomotorio. La malattia colpisce 1/25.000 nati. La sindrome di Angelman è una malattia neurologica caratterizzata da grave ritardo mentale e dismorfismi facciali caratteristici.

Sindrome di Charcot-Marie-Tooth: è una neuropatia periferica ereditaria, la cui prevalenza è stimata 1/2500. E’ caratterizzata da atrofia muscolare e neuropatia sensitiva progressiva che colpisce le estremità degli arti, spesso associata a piedi cavi. Generalmente esordisce prima dei 20 anni e colpisce inizialmente gli arti inferiori. L’evoluzione è cronica e lentamente progressiva.

Può essere trasmessa con tutti i modelli ereditari mendeliani. La trasmissione dominante è la più diffusa in Europa. Sono note tre forme: demielinizzante (CMT1), dominante legata all’X (CMTX1) e neuronale (CMT2). Alcuni geni sono noti solo per le prime due forme, CMT1 e CMTX1. Attualmente, la diagnosi presintomatica può essere quindi presa in esame soltanto relativamente a queste due forme. Non esiste nessuna terapia risolutiva; in compenso è necessario adottare misure preventive: chinesiterapia, uso di stecche, chirurgia ortopedica e vari ausili tecnici.

Sindrome Cri-du-chat: è una malattia cromosomica dovuta alla delezione di una porzione variabile del braccio corto del cromosoma 5 (5p-). I segni clinici principali comprendono il pianto acuto monotono (da cui origina il nome della sindrome del ‘miagolio del gatto”), la microcefalia, tratti caratteristici del volto e il grave ritardo psicomotorio e mentale.

Sindrome di Di George: è una malattia dovuta ad una microdelezione nella regione cromosomica 22q11.2, ed è caratterizzata dall’insieme di diverse malformazioni: ipoplasia del timo e delle ghiandole paratiroidi, cardiopatia congenita e dimorfismi del viso caratteristici.

Lissencefalia isolata: è un grave disturbo della migrazione neuronale caratterizzato da circonvoluzioni corticali assenti (agiria) o diminuite (pachigiria) e da una corteccia ispessita. Sono stati descritti diversi tipi di lissencefalia: la forma più comune, nota come lissencefalia classica o di tipo 1, è caratterizzata da una corteccia spessa 10-20 mm (invece dei 2-3 mm della corteccia normale); il quadro più lieve è invece rappresentato dalla eterotopia a banda sottocorticale (SBH) in cui sono presenti bande bilaterali di sostanza grigia all’interno della sostanza bianca tra la corteccia e i ventricoli laterali. Nella SBH la corteccia ha una struttura microscopicamente normale ma può presentare una superficie semplificata con solchi poco profondi. La lissencefalia classica è una malformazione rara con una prevalenza di 11.7 per milioni di nati.

Sindrome di Miller-Dieker: è una sindrome da delezione di geni contigui sul cromosoma 17p13.3, caratterizzata da lissencefalia classica (lissencefalia tipo 1) e segni facciali caratteristici. Possono fare parte di questa condizione altre malformazioni congenite. La MDS è, senza dubbio, una malattia rara osservata fino ad oggi in 11, 7 nati per milione di nati vivi, anche se la prevalenza e l’incidenza sono probabilmente sottostimate. I bambini con MDS presentano un grave ritardo di crescita, di solito associato a epilessia e disturbi dell’alimentazione.

La lissencefalia rappresenta lo spettro fenotipico estremo di un quadro di agiria generalizzata o agiria e pachigiria frontale. In quasi il 100% dei pazienti sono presenti delezioni visibili o submicroscopiche della regione 17p13.3, che coinvolgono il gene LIS1. La presa in carico dei bambini con MDS è sintomatica. Per evitare le complicazioni legate ai problemi alimentari e della deglutizione (scarso stato nutrizionale, polmonite ab ingestis), si possono usare tubi nasogastrici e si può effettuare una gastrostomia (soluzione a lungo termine). È molto importante il controllo delle convulsioni.

Sindrome della Neuropatia Ereditaria (HNPP): è una forma di neuropatia sensitivo-motoria caratterizzata da episodi di paralisi e di parestesia in un territorio circoscritto e definito (per esempio, sindrome del tunnel carpale oppure paralisi del nervo peroneale con disturbi al piede). In genere, questi episodi (spesso causati da un piccolo trauma o da una prolungata compressione della regione interessata) regrediscono, ma le recidive sono comunque frequenti. Talvolta, invece, la paralisi è permanente. La malattia si manifesta in genere dopo i 20 anni.

La neuropatia ereditaria ipersensibile alla pressione è associata ad alterazioni del gene PMP22, localizzato sul cromosoma 17 e si trasmette con modalità autosomica dominante: un genitore con l’alterazione (e quindi con la malattia) ha il 50% di probabilità di trasmettere la malattia a ciascuno dei propri figli. La diagnosi si basa sulla storia clinica e familiare del paziente e può essere confermata dall’analisi genetica, con ricerca di alterazioni a carico dl gene PMP22. Nelle famiglie a rischio è possibile effettuare diagnosi prenatale conoscendo il tipo di alterazioni coinvolte. Non esiste un trattamento risolutivo. La terapia è sintomatica e preventiva, ovvero mira alla prevenzione delle compressioni dei nervi: consigliato, per esempio, non stare troppo a lungo seduti con le gambe incrociate o sdraiati sui gomiti.

Sindrome di Rubinstein-Taybi: è una sindrome caratterizzata da un aspetto particolare del volto (sopracciglia fortemente arcuate, ciglia lunghe, naso a becco, ridotto sviluppo della mandibola, incisivi appuntiti, sorriso atipico associato a chiusura quasi completa degli occhi), da altre anomalie strutturali, come la presenza di pollici e alluci molto larghi, da ritardo della crescita postnatale.

La sindrome è inoltre associata a deficit cognitivo di grado variabile e a disturbi comportamentali (specie durante l’età adulta: sbalzi d’umore e comportamenti ossessivo-compulsivi). Altre caratteristiche eventualmente presenti sono le cardiopatie congenite, la tendenza a sviluppare obesità verso la pubertà , alcune anomalie oculari (come il coloboma) e un aumento del rischio di alcune forme di tumore.

Sindrome di Sotos: è una rara malattia genetica caratterizzata da crescita eccessiva durante l’infanzia, eccessivo sviluppo del cranio (macrocefalia), aspetto peculiare del viso, difficoltà di apprendimento di grado variabile in associazione ad altri segni clinici. Si stima che la frequenza sia compresa tra 1:10.000 e 1:50.000 nati vivi.

La sindrome di Sotos è dovuta a mutazioni o delezioni del gene NSD1 (localizzato sul cromosoma 5q35) responsabile della sintesi di una proteina che controlla l’attività di un gruppo di geni coinvolti nei processi di crescita e di sviluppo dell’organismo. Il 90% circa delle anomalie di NSD1 è de novo ossia insorta per la prima volta nella persona affetta e pertanto sono molto rari i casi familiari (meno del 2%). Si dice in gergo tecnico che la mutazione è de novo quando è avvenuta durante la formazione della cellula uovo o dello spermatozoo oppure nelle primissime fasi di sviluppo embrionale.

Nel restante 10% circa dei casi la modalità di trasmissione è autosomica dominante: una persona con sindrome di Sotos ha un rischio del 50% di avere un figlio con la sua stessa condizione, sebbene i sintomi e la loro gravità varino molto anche all’interno della stessa famiglia. I sintomi si manifestano fin dalla nascita con peso e altezza superiori alla norma (macrosomìa fetale), macrodolicocefalia (testa grande e allungata in senso anteroposteriore), volto allungato e stretto, fronte ampia e prominente, impianto alto dei capelli sulla fronte, capelli radi soprattutto in regione frontoparietale, fessure palpebrali rivolte verso il basso, occhi molto distanziati (ipertelorismo), palato ogivale, mandibola stretta e prominente, mento squadrato e a punta.

Altre anomalie sono malformazioni cerebrali, anomalie genito-urinarie, malformazioni cardiache, scoliosi; possono verificarsi crisi epilettiche. È di regola ritardato il raggiungimento delle principali tappe dello sviluppo neuro-psicomotorio: primi passi e prime parole. È presente ritardo motorio (ipotonia) e del linguaggio, inoltre vi è anche un ritardo dello sviluppo cognitivo con disabilità intellettiva e problemi comportamentali (deficit di attenzione ed iperattività), fobie, aggressività, impulsività, irritabilità e disturbi ossessivo-compulsivi. Circa il 90% dei bambini con sindrome di Sotos ha un’altezza e/o una circonferenza cranica superiori alla media.

L’iperaccrescimento è particolarmente marcato nei primi 3-4 anni di vita per rientrare nella norma - ma sempre ai limiti superiori - dopo i 5 anni di età; si osserva una maturazione ossea anticipata, più evidente nei primi anni di vita (età ossea accelerata). La circonferenza cranica rimane solitamente con valori abnormemente elevati (superiori al 97° percentile).La condizione è inoltre associata ad un lieve aumento di rischio tumorale (2% circa degli affetti), che si manifesta principalmente in età pediatrica. Le neoplasie maggiormente osservate sono il teratoma sacrococcigeo, il ganglioneuroma, il neuroblastoma, la leucemia linfoblastica acuta e il carcinoma polmonare a piccole cellule.

Il sospetto clinico si basa sulla raccolta della storia clinica e sulla visita che dimostreranno le manifestazioni sopra riportate. La conferma diagnostica viene dall’analisi del gene NSD1 e dalla dimostrazione delle mutazioni specifiche. Il trattamento è esclusivamente sintomatico. La bambina o il bambino va preso in carico da un’équipe multispecialistica (pediatra, pediatra endocrinologo, genetista, neurologo, ortopedico…) e necessita quasi sempre di un supporto fisioterapico, psicoterapeutico e di logopedia.

Sindrome Trico-Rino-Falangea: le sindromi tricorinofalangee tipo 1 e 3 sono sindromi malformative caratterizzate da bassa statura, capelli radi, naso globoso, epifisi “a cono” e un importante accorciamento di tutte le ossa delle falangi, dei metacarpi e dei metatarsi. Sono stati descritti più di 100 casi. Le forme tipo 1 e 3 sono varianti della stessa malattia: il tipo 3 è la forma più grave, con statura molto bassa e brachidattilia molto marcata. Queste due forme si distinguono dalla sindrome tricorinofalangea tipo 2 (si veda questo termine) per l’assenza del deficit cognitivo e delle esostosi. La trasmissione delle sindromi tipo 1 e 3 è autosomica dominante. Sono dovute alle mutazioni del gene TPRS1 localizzato sul cromosoma 8q24.12. Il trattamento è sintomatico. Può essere proposta la chirurgia plastica.

La Sindrome di Smith-Magenis: è una malattia genetica complessa con deficit cognitivo variabile, disturbi del sonno, anomalie craniofacciali e scheletriche, disturbi psichiatrici, ritardo motorio e del linguaggio. La prevalenza mondiale è di 1/15.000-25.000. Sono comuni il deficit cognitivo lieve-moderato, il ritardo significativo del linguaggio, la ridotta sensibilità al dolore, la neuropatia periferica, i disturbi del sonno (caratteristici) e i comportamenti disadattivi (capricci/scatti d'ira, ricerca costante dell'attenzione, aggressività, disobbedienza, distrazione e comportamenti autolesionistici).

La Sindrome di Wolf-Hirschhorn: è una malattia dello sviluppo, determinata da una delezione del braccio corto del cromosoma 4 (regione 4p16.3), e caratterizzata da segni craniofacciali caratteristici, ritardo della crescita prenatale e postnatale, deficit cognitivo, grave ritardo dello sviluppo psicomotorio, convulsioni e ipotonia. La prevalenza è di 1:50.000 nati.

Grazie a una sofisticata analisi bioinformatica, si ha la possibilità di definire con esattezza non solo la regione genomica alterata ma anche i geni in essa contenuta, permettendo così di verificare la patogenicità dell’anomalia cromosomica riscontrata e valutare le conseguenze cliniche.

Array-CGH

L'analisi array-CGH, rappresenta anche una tecnica ideale di approfondimento diagnostico di 2^ livello, eseguita per integrare l’analisi citogenetica prenatale al fine di definire più accuratamente eventuali anomalie cromosomiche precedentemente identificate o per rivelare microriarrangiamenti non evidenziabili con l’indagine del cariotipo fetale.

Vantaggi dell'Amniocentesi Molecolare

Questa tecnica innovativa si differenzia cariotipo tradizionale prenatale in quanto meno laboriosa e facilmente automatizzabile, e quindi meno soggetta a rischio di errore.

Nessun rischio di insuccesso della coltura, garantendo un risultato nel 100% dei casi.

Diagnostica Prenatale Molecolare Infettivologica

In caso di necessità diagnostica, l’amniocentesi genetica può essere integrata dalla diagnostica prenatale molecolare infettivologica, che consiste nell’effettuare la ricerca con tecniche molecolari della presenza del genoma di agenti infettivi, (es. Citomegalovirus, Herpes simplex, Varicella Zooster, Rubeovirus, HIV, Toxoplasma gondii, Parvovirus). Il vantaggio del ricorso alla tecnica molecolare (Polimerase Chain Reaction - PCR) risiede nel fatto che si ricerca direttamente il genoma, ossia la forma replicativa, dell’agente infettivo, superando i metodi tradizionali indiretti che esprimevano la produzione anticorpale fetale (IgM).

Tali metodi infatti risultano molto imprecisi poiché dipendono molto dalla variabile maturità del sistema immunitario a sua volta legato all’età gestazionale.

Malattie Genetiche Rilevabili

Fibrosi Cistica (FC)

La fibrosi cistica (FC) è una grave malattia ereditaria che colpisce alla nascita 1 bambino su 2500. Nei pazienti affetti da FC, le secrezioni (cioè i liquidi biologici come il muco, il sudore, la saliva lo sperma, i succhi gastrici) sono molto più dense e viscose del normale. I problemi più gravi sono a carico dei polmoni, dove il muco estremamente denso può causare problemi respiratori e infezioni.

La FC è una malattia che si trasmette con modalità autosomica recessiva, determinata da alterazioni del DNA, chiamate “mutazioni”, che insorgono in entrambe le copie del gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Negli soggetti malati, entrambe le copie del gene sono alterate. Gli individui che possiedono una sola copia del gene alterato e una normale sono invece privi di ogni sintomo, ma sono portatori sani e avranno una probabilità del 25 % di avere figli affetti da FC.

Oggi, attraverso un test genetico (studio del DNA), è possibile eseguire sul liquido amniotico o sui villi coriali la ricerca delle mutazioni più frequenti che causano la FC (screening 34 o 48 mutazioni), che nel complesso permette di identificare circa l’85% dei casi di FC nella nostra popolazione. Se l’analisi molecolare dovesse riscontrare una mutazione, permane comunque un rischio residuo di circa 1 su 500 che il feto sia affetto da FC, per la presenza di un’altra mutazione più rara.

Sindrome di Martin-Bell o del Cromosoma X Fragile

La sindrome di Martin-Bell o del cromosoma X fragile è la forma più comune di ritardo mentale dopo la sindrome di Down, in quanto interessa 1:4000 maschi e 1:6000 femmine. L’X-Fragile è una malattia ereditaria causata dall’alterazione di un gene (FMR1) localizzato nel cromosoma X, e colpisce molto più frequentemente i maschi rispetto alle femmine, dato che queste ultime possiedono 2 copie del cromosoma X.

Lo sviluppo mentale delle persone affette da tale malattia è molto vario. È noto che nella maggior parte dei casi di X-Fragile, l’alterazione responsabile della sindrome è l’espansione, attraverso le generazioni, di un tratto di DNA del gene FMR1, costituito da una sequenza ripetuta di tre basi nucleotidiche (CGG). Mentre nelle persone normali queste basi sono ripetute in un numero variabile da 5 a 58 volte, nelle persone malate sono invece ripetute più di 200 volte.

Alcune persone possiedono un numero di ripetizioni intermedie all’interno del gene FMR1 (da 59 a 200) che non provocano alcun effetto.

Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)

La DMD è determinata da alterazioni di un gene localizzato nel cromosoma X, che contiene le informazioni per la produzione di una proteina chiamata distrofina. Le mutazioni, possono essere di vario tipo e comprendono sia delezioni (le più frequenti), sia sostituzioni nucleotidiche, ma tutte hanno come effetto quello di causare l’assenza totale della proteina.

Come tutte le malattie a legate al cromosoma X, la DMD si manifesta solo nei maschi (che hanno un solo cromosoma X), mentre le femmine, a parte alcune eccezioni, sono portatrici sane (perché possiedono un altro cromosoma X, oltre a quello mutato, che può compensarne le funzioni).

Sordità Congenita

La sordità congenita è una malattia molto comune che colpisce, nella popolazione italiana, circa 6 milioni di persone. L’analisi molecolare prenatale del gene CX26 permette di ricercare nel DNA fetale la presenza delle mutazioni più frequenti che causano la malattia. Ad oggi sono state identificate ben 90 mutazioni del gene CX26.