Scopri l’Accuratezza dell’Amniocentesi nella Determinazione del Sesso e Diagnosi di Anomalie Cromosomiche

L'amniocentesi è un esame diagnostico invasivo utilizzato per valutare la salute del feto durante la gravidanza. Si tratta di una procedura che consente il prelievo transaddominale di liquido amniotico (L.A.). L'amniocentesi è certamente la metodica più diffusa, ma anche la più antica di questa giovane disciplina. Durante la gravidanza il feto è circondato dal liquido amniotico, una sostanza simile all’acqua che contiene cellule fetali e altre sostanze che forniscono informazioni importanti sulla salute del feto.

Che cos'è l'amniocentesi?

L’amniocentesi è, infatti, un test prenatale in cui una piccola quantità di liquido amniotico viene rimossa dalla membrana che circonda il feto per verificare eventuali disturbi genetici del futuro bambino. È solo nel 1950 che l’amniocentesi venne utilizzata per indagare lo stato di salute fetale con l’analisi spettrofotometrica della bilirubina sul liquido amniotico valutando in tal modo la compromissione fetale nella isoimmunizzazione. Oggi l’ago viene sempre introdotto sotto guida diretta ultrasonica così da visualizzarne con accuratezza il tragitto.

Quando viene eseguita?

La procedura di solito è prevista tra la 15° e la 18° settimana della gravidanza.

Cosa può rilevare un'amniocentesi?

Questo tipo di esame è in grado di diagnosticare:

Sindrome di Down
Anemia falciforme
Fibrosi cistica
Distrofia muscolare
Difetti del tubo neurale (cervello e colonna vertebrale non si sviluppano correttamente)
Il sesso del feto

La precisione dell’amniocentesi è di circa il 99,4%. Le anomalie cromosomiche sono alterazioni del numero o della struttura dei cromosomi.

Come viene eseguita l'amniocentesi?

Sotto la guida ecografica, un ago sottile è inserito nell’utero attraverso l’addome e raggiunge il sacco amniotico, dove viene rimosso un piccolo campione di liquido amniotico. Generalmente si usa un ago da 20 o 21 gauge da cui, una volta collocato nel sito prescelto, è rimosso il mandrino e vi si collega una siringa per il prelievo di circa 20 ml di liquido. Il sito di inserzione dell’ago deve permettere che si raggiunga una tasca con un adeguato volume di liquido amniotico, non comprendere parti fetali né il cordone ombelicale ed evitare i vasi del piatto coriale. Il fluido viene quindi inviato a un laboratorio per le analisi. Dopo un’amniocentesi, si consiglia di evitare attività faticose e rapporti sessuali almeno per un giorno.

Poi è possibile riprendere tutte le normali attività quotidiane.

Amniocentesi nella Gravidanza Multipla

Nella gravidanza multipla l’esame ultrasonografico, che precede l’amniocentesi, deve visualizzare con precisione la membrana che separa i sacchi, oltreché la posizione dei feti all’interno di ogni singolo sacco. In tal modo, come si è detto, ci si accerta che il secondo prelievo non derivi dal medesimo sacco.

Analisi del Cariotipo da Liquido Amniotico

L'analisi del cariotipo è lo studio del corredo cromosomico di un individuo. Il cariotipo da liquido amniotico viene effettuato mediante il prelievo di 20 ml di liquido amniotico per via trans-addominale, sotto controllo ecografico, tra la 15° e la 18° settimana di gestazione.

Il liquido prelevato viene centrifugato per separare la parte liquida (che verrà utilizzata per il dosaggio dell’alfafetoproteina) dalla frazione corpuscolata, costituita dalle cellule fetali che sono in sospensione nel liquido amniotico. Tali cellule, definite amniociti, sono poste in coltura con un terreno nutritivo in un adatto incubatore, alla temperatura di 37°C, in queste condizioni le cellule possono continuare continuare a vivere al di fuori dell'organismo.

Vengono allestite 3 colture distinte in contenitori sterili costituiti da una plastica particolare che lascia aderire gli amniociti e ne consente la moltiplicazione. Ciascuna cellula che aderisce alla fiasca di coltura inizia la divisione cellulare e forma un “clone” di cellule tutte uguali tra loro. Quando i cloni sono ben sviluppati e in numero sufficiente, e ciò avviene in media in 12-15 giorni, le cellule vengono staccate e deposte su un vetrino sterile (metodica di tripsinizzazione) che favorisce ulteriormente la moltiplicazione cellulare.

Dopo 3 giorni la divisione cellulare viene bloccata in tutte le cellule allo stadio di metafase, con 46 cromosomi ben spiralizzati, tutti composti da due cromatidi e allineati sul piano centrale della cellula ("equatore"). A questo punto la cellula viene aperta con una sostanza ipotonica che rigonfia il nucleo e provoca la rottura della membrana nucleare. Ciò causa lo spargimento dei cromosomi nella zona del vetrino dove prima era situato il nucleo, che possono essere colorati con tecniche diverse, osservati al microscopio e fotografati.

I cromosomi vengono disposti in ordine decrescente rispetto alle dimensioni, dal più grande al più piccolo, e avvicinando, a coppie, i due cromosomi uguali od omologhi (ogni membro di una coppia di cromosomi omologhi deriva dal proprio padre ed uno dalla propria madre). Al termine, potremo osservare che sono presenti 22 coppie di cromosomi omologhi, numerate da 1 a 22, per un totale di 44 cromosomi (ad es.: due cromosomi 1, due cromosomi 2, due cromosomi 3, e così via fino a 22). I due rimanenti cromosomi, i cromosomi sessuali o “gonosomi”, sono di due tipi, detti "X" e "Y" per la somiglianza della loro forma a queste due lettere dell'alfabeto.

Il cromosoma X è piuttosto grande, di dimensioni simili a quelle del cromosoma 6, mentre il cromosoma Y è molto piccolo, solitamente di dimensioni simili ad un cromosoma 21 o 22 e contiene pochi geni.

Insuccesso della Coltura

E' possibile talora che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente, in quanto sono presenti numerose cellule di tipo epiteliale di origine materna che impediscono la crescita anche minima. Si parla in questo caso di insuccesso della coltura. Questa evenienza è comunque rara (avviene in 1 caso su 500). E’ importante mettere in evidenza che la mancata crescita non è assolutamente indice di condizione patologica del feto.

Anomalie Cromosomiche

Le anomalie numeriche dei cromosomi, che vengono chiamate anche aneuploidie, sono caratterizzate da un numero maggiore o inferiore di cromosomi rispetto al numero standard. Si parla, ad esempio, di trisomia, quando si riscontra la presenza di un cromosoma in più. A questo gruppo di anomalie cromosomiche appartengono patologie note come Sindrome di Down o Trisomia 21, dove l’individuo presenta 47 cromosomi, ovvero possiede una copia in più del cromosoma 21. La trisomia 13, invece, prende il nome di Sindrome di Patau, mentre la trisomia 18, Sindrome di Edwards.

Si parla, invece, di monosomia, quando si riscontra l’assenza di un cromosoma. Per quanto riguarda i cromosomi sessuali, X ed Y, la situazione è diversa. Infatti in questi casi l’aberrazione non è una vera e propria trisomia bensì la perdita o l’aggiunta di uno dei due cromosomi rispetto all’assetto normale XX che caratterizza il sesso femminile od XY proprio di quello maschile.

Tra le aneuploidie, le trisomie 21, 18, 13 e le aneuplidie dei cromosomi sessuali (es. monosomia X), comprendono circa l’80%-95% delle possibili anomalie cromosomiche rivelabili tramite la determinazione del cariotipo.

Il meccanismo principale con cui si producono le aneuploidie è costituito dalla non-disgiunzione, ovvero dalla mancata separazione dei cromosomi omologhi o dei cromatidi durante la meiosi nel corso della gametogenesi.

È ormai noto che dell’incidenza di anomalie cromosomiche è direttamente proporzionale all’età materna. In particolare per la sindrome di Down si calcola che oltre i 40 anni una gravidanza su 100 sia interessata da questo tipo di anomalia.

Diagnosi Rapida di Aneuploidie Fetali: QF-PCR

Nell’ambito della diagnosi prenatale, oltre ai test genetici già descritti, è sempre più utilizzata una tecnica di diagnostica molecolare che permette diagnosi rapida di alcune aneuploidie fetali (quelle relative ai cromosomi 21, 13, 18, X e Y), conosciuta come amplificazione enzimatica in vitro del DNA fluorescente o QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR).

Oggi tal tecnica, che si e’ ormai sostituita completamente alla tecnica di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH), affianca le analisi citogenetiche tradizionali eseguite di routine e dalle quali si differenzia per una maggiore rapidità (risultato disponibile entro entro 24h-48h dal prelievo), per la necessità di una minore quantità di liquido amniotico (1-1,5 ml), 1-2 villi coriali, 0,1 ml di sangue fetale, partendo da DNA estratto da materiale cellulare non coltivato.

Il fattore più importante, rispetto alle tecniche tradizionali, è legato alla possibilità di eseguire test di laboratorio precisi, affidabili e soprattutto rapidi partendo da una minima quantità di materiale, a volte anche da poche cellule.

Per quanto riguarda i cromosomi sessuali viene impiegata una sequenza relativa al gene dell’amelogenina. In questo caso un campione che presenta 1 picco nell’amelogenina ed 1 o 2 picchi nel DXS8377 indica un assetto cromosomico femminile normale (XX); mentre un campione con 2 picchi di differente dimensione a livello dell’amelogenina ed 1 picco nel DXS8377 un assetto cromosomico maschile normale (XY).

L’applicazione della tecnica QF-PCR in epoca prenatale per il riconoscimento di alcune anomalie cromosomiche di numero, ha alcune limitazioni. Nel caso di QF-PCR positiva per una trisomia, l’esame non permette di distinguere tra una vera trisomia fetale ed un mosaicismo confinato alla placenta (o ad altri tessuti extra fetale) privo di significato patologico per il feto.

Cariotipo Tradizionale vs. Analisi Molecolare dei Cromosomi

L’approccio tradizionale nella diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche comporta la messa in coltura di cellule fetali ricavate da prelievi di liquido amniotico e la determinazione del cariotipo tramite l’analisi al microscopio dei cromosomi in metafase. Benchè tale analisi sia abbastanza accurata, le colture cellulari impongono lunghi tempi di attesa che si aggirano intorno ai 15-20 giorni.Il cariotipo tradizionale, inoltre, non garantisce che il feto sia esente da malattie genetiche o alterazioni cromosomiche (delezioni o duplicazioni) di piccole dimensioni. Infatti, questo tipo di esame fornisce informazioni solo sulle principali anomalie cromosomiche (ad esempio la trisomia 21, o Sindrome di Down, le trisomie 18 e 13, la monosomia X, o Sindrome di Turner) attraverso la determinazione dell’intero assetto cromosomico fetale.

Lo studio del cariotipo fetale, a differenza dell’amniocentesi rapida con la tecnica QF-PCR, presenta un’ importanza diagnostica elevatissima perché evidenzia le anomalie cromosomiche più severe e frequenti ( come ad esempio le trisomie ) a carico di tutti i cromosomi, tuttavia, a causa dei limiti di risoluzione della tecnica, piccoli riarrangiamenti cromosomici potrebbero non essere facilmente evidenziabili.

Rispetto all’esame citogenetico tradizionale, l’analisi molecolare dei cromosomi ha una risoluzione molto più elevata (ca. 100 volte). Ciò consente di identificare alcune patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche (microdelezioni e le micro duplicazioni), non evidenziabili tramite il cariotipo tradizionale, aumentando sensibilmente l’accuratezza dell’esame.

Il cariotipo molecolare, infatti, consente di effettuare rapidamente non solo lo studio dell’assetto cromosomico fetale, ma anche di un gruppo di 100 patologie causate da microdelezione / microduplicazione cromosomica.

L’ analisi array-CGH, rappresenta anche una tecnica ideale di approfondimento diagnostico di 2^ livello, eseguita per integrare l’analisi citogenetica prenatale al fine di definire più accuratamente eventuali anomalie cromosomiche precedentemente identificate o per rivelare microriarrangiamenti non evidenziabili con l’indagine del cariotipo fetale.

Questa tecnica innovativa si differenzia cariotipo tradizionale prenatale in quanto meno laboriosa e facilmente automatizzabile, e quindi meno soggetta a rischio di errore. Il test non può escludere la presenza di tutte le anomalie cromosomiche fetali. Questo esame valuta solo le aneuploidie a carico dei cromosomi 13, 18, 21, X e Y; le aneuploidie di altri cromosomi non sono identificabili.

L’esame inoltre non è in grado di evidenziare riarrangiamenti cromosomici bilanciati, alterazioni parziali dei cromosomi analizzati, alterazioni cromosomiche strutturali, mosaicismi cromosomici fetali e/o placentari a bassa percentuale (cioè la presenza di due linee cellulari con differente assetto cromosomico, con una linea cellulare scarsamente rappresentata), mutazioni puntiformi, difetti di metilazione, poliploidie. Il test non evidenzia altre malformazioni o difetti non specificamente ricercati.

Rischi dell'Amniocentesi

L’amniocentesi presenta piccoli rischi sia per la madre sia per il feto, il test prenatale è generalmente consigliato solo a donne che hanno un significativo rischio di malattie genetiche.

Erroneamente, diversi studiosi, hanno creduto che le amniocentesi transplacentari fossero associate ad un più alto rischio di abortività spontanea rispetto alla via transamniotica.

In molti casi conviene addirittura trapassare con l’ago la parete posteriore della cavità. In tal modo la membrana amniotica viene obbligatoriamente forata. Ritraendo poi l’ago, si penetra immancabilmente nello spazio amniotico. Se necessario, l’ago può essere introdotto una seconda volta, con la medesima procedura, ma solitamente non più di due volte.

Il rischio abortivo peraltro non supera di molto quello esistente nella gravidanza singola, benché alcuni hanno pensato, su base puramente teorica, che fosse esattamente il doppio, in base al fatto che si dovesse effettuare un doppio prelievo.

Il rischio di Rh sensibilizzazione postamniocentesi è sconosciuto. Infatti la letteratura più datata parlava circa dell’1% mentre attualmente si ritiene che il rischio sia praticamente inesistente.

Esiste la possibilità di artefatti “in vitro”. Questo può avvenire infatti dal 2% al 3% delle colture. Tra le altre si verificano più frequentemente poliploidie. Il cromosoma 20, per esempio, è uno dei cinque cromosomi più frequentemente coinvolti in pseudomosaicismi.

La sempre maggiore richiesta di ottenere risposte citogenetiche precoci ha indotto, negli ultimi anni, ad eseguire il prelievo del liquido amniotico sempre più precocemente. Ciò anche in relazione alla possibilità che il prelievo del liquido amniotico in epoca inferiore alla 15a settimana di gestazione si ponesse come una valida alternativa al prelievo dei villi coriali.

Tale procedura, almeno agli inizi della sua introduzione clinica, era gravata da un maggior rischio abortivo ed è tutt’ora innegabilmente caratterizzata da una più alta incidenza di insuccessi diagnostici, o per mancata coltura o per errori di genere tecnico.

Screening delle Anomalie Metaboliche

Pur nei limiti della sua attendibilità (poiché limitata da alcuni falsi negativi) oggi si tende ad eseguire anche lo screening delle più frequenti anomalie metaboliche mediante l’analisi biochimica del liquido amniotico.

Diagnostica Prenatale Molecolare Infettivologica

In caso di necessità diagnostica, l’amniocentesi Genetica può essere integrata dalla diagnostica prenatale Molecolare infettivologica, che consiste nell’effettuare la ricerca con tecniche molecolari della presenza del genoma di agenti infettivi, (es. Citomegalovirus, Herpes simplex, Varicella Zooster, Rubeovirus, HIV, Toxoplasma gondii, Parvovirus).

Il vantaggio del ricorso alla tecnica molecolare (Polimerase Chain Reaction - PCR) risiede nel fatto che si ricerca direttamente il genoma, ossia la forma replicativa, dell’agente infettivo, superando i metodi tradizionali indiretti che esprimevano la produzione anticorpale fetale (IgM). Tali metodi infatti risultano molto imprecisi poiché dipendono molto dalla variabile maturità del sistema immunitario a sua volta legato all'età gestazionale.

Indagini non Invasive: Bitest e NIPT

Esistono diverse indagini prenatali, sviluppate negli ultimi 50 anni, per poter cercare di stabilire se un feto sia affetto o meno da alcune patologie genetiche. Tra le indagini non invasive, troviamo diversi test ma i più affidabili sono il bitest e il NIPT (ricerca del dna fetale nel sangue materno). Le indagini non invasive non hanno rischio di aborto ma non sono considerate esami diagnostici ma test di screening; infatti i risultati di questi esami si esprimono in termini di probabilità.

NIPT (Non Invasive Prenatal Testing)

Il NIPT (Non Invasive Prenatal Testing) è costituito da un prelievo di sangue materno nel quale, attraverso indagini molecolari, viene ricercato DNA fetale. Il DNA fetale, DI ORIGINE PLACENTARE, nel sangue materno, è rintracciabile a partire dalla 10° settimana di gravidanza. Il DNA fetale presente nel campione ematico prelevato non deve essere inferiore al 4%. Se fosse inferiore al 4%, e questo avviene nel 2% dei casi, l’analisi dei cromosomi fetali non è possibile.

Ad oggi esistono sul mercato sempre più test che vanno ad indagare un numero sempre maggiore di cromosomi.L’indagine base si sofferma sulla ricerca di aneuploidie (alterazioni di numero dei cromosomi) dei cromosomi 21, 13 e 18. Da questo pannello base, è possibile aggiungere la ricerca di sempre più cromosomi e sindromi da microdelezione cromosomica (perdita di alcuni piccolissimi pezzetti di cromosomi, non indagabili neanche con l’amniocentesi/villocentesi).Circa il 50% delle anomalie cromosomiche riscontrabili con l’amnio/villocentesi riguardano le trisomie dei cromosomi 21,13,18. Queste 3 anomalie sono l’obiettivo primario del NIPT.

La sensibilità (risultati falsi negativi) e specificità (risultati falsi positivi) dello screening per le aneuploidie (discrepanze nel numero dei cromosomi) dei cromosomi 21,13 e 18 si aggira, rispettivamente tra il 92-99% per la sensibilità é superiore al 99% per la specificità.

Attraverso il NIPT è possibile cercare anche le aneuploidie dei cromosomi sessuali (X e Y) e cercare alcune microdelezioni associate a sindromi clinicamente riconoscibili. Più una patologia è rara, minore sarà l’affidabilità del test.

Amniocentesi vs. Villocentesi

L’amniocentesi è l’indagine invasiva più diffusa in Italia (>100.000 prelievi/anno) e prevede, mediante una puntura transaddominale, sotto guida ecografica, di prelevare piccole quantità di liquido amniotico. Viene eseguita dalla 16° alla 18° settimana di gravidanza e il rischio di aborto collegato a questa pratica si assesta intorno allo 0,5-1% ma varia ampiamente rispetto all’esperienza dell’operatore. Il liquido amniotico prelevato, viene inviato in laboratorio e analizzato.

La villocentesi, invece, è un prelievo di una piccola quantità di villi coriali, eseguita sempre sotto controllo ecografico per puntura transaddominale. In Italia vengono eseguiti circa 25000 prelievi all’anno. La villocentesi viene eseguita generalmente intorno alla 10°-13° settimana di gravidanza. Il rischio di aborto, è lievemente più alto rispetto a quello dell’amniocentesi (1-3%) anche se, in mani esperte, questa percentuale diminuisce considerevolmente. Le cellule prelevate, vengono analizzate e viene eseguito, anche in questo caso, il cariotipo placentare.

Nell’1-2% dei campioni è possibile individuare la presenza di un mosaicismo feto-placentare che nella maggior parte dei casi, circa l’80%, non coinvolge il feto.