Diagnosi Citologica della Leishmaniosi Canina: Come Identificare gli Amastigoti di Leishmania Infantum in Modo Efficace

La leishmaniosi canina è una malattia infettiva molto frequente in Italia. È diffusa in tutto il bacino del Mediterraneo, in Medio Oriente, in Asia ed in sud America. In Italia, molti anni fa la malattia era frequente nella sola zona costiera e nel centro-sud. Attualmente, la leishmaniosi è endemica anche in diverse aree dell'entroterra del nord Italia.

La malattia nel cane è causata da un microorganismo (un protozoo) che si chiama Leishmania infantum. La Leishmaniosi è una malattia cronica sistemica trasmessa da Leishmania infantum che viene trasmessa da un vettore (flebotomo). E’ una patologia endemica nel bacino del mediterraneo e il cane rappresenta uno dei principali serbatoi dell’infezione.

La leishmaniosi nel cane è una malattia che colpisce uno o più organi contemporaneamente. Gli organi maggiormente colpiti sono i reni, la cute, gli occhi e l’apparato muscolo-scheletrico. Il parassita induce un’importante risposta immunitaria la quale è alla base dei danni d’organo riscontrati nei cani malati.

Segni Clinici e Diagnosi

Il cane può essere affetto da leishmaniosi se presenta uno o più dei seguenti segni clinici: stanchezza o apatia, lesioni cutanee, lesioni oculari, mucose pallide, perdita di peso, sanguinamento dal naso, zoppie o difficoltà deambulatorie, aumento della sete e dell’urinazione. Poiché i segni clinici possono essere riferibili anche ad altre patologie, è importante rivolgersi al medico veterinario per una valutazione approfondita del caso.

La presenza dei segni clinici assume maggior rilievo se il cane ha viaggiato o vive in un’area endemica per la leishmaniosi (ovvero in un territorio dove la leishmaniosi è molto frequente nei cani) e se non riceve corretta profilassi anti-parassitaria contro i flebotomi.

Il medico veterinario sospetta la leishmaniosi nel cane quando sono presenti segni clinici e/o alterazioni degli esami del sangue e delle urine compatibili con la malattia. Per esempio, gli esami del sangue possono indicare la presenza di anemia, riduzione delle piastrine, disfunzione renale, aumento delle proteine totali e globuline, mentre gli esami delle urine possono indicare proteinuria (perdita di proteine). Dal momento che la leishmaniosi nel cane è una malattia complessa, le alterazioni di laboratorio e le loro combinazioni possono essere innumerevoli.

Per confermare la diagnosi, il medico veterinario effettua ulteriori indagini volte ad identificare la presenza di Leishmania infantum (esami citologici, amplificazione del DNA del microorganismo) o degli anticorpi che il cane ha sviluppato contro Leishmania infantum (esami sierologici).

Diagnosi di Laboratorio

La diagnosi di Leishmaniosi nel cane è una diagnosi prettamente di laboratorio che deve essere effettuata dal medico veterinario con esami indiretti (titolazione anticorpale) e diretti (volti all’evidenziazione del parassita) spesso eseguiti in associazione. Va comunque segnalato che non esistono test o esami ematologici in grado di escludere con certezza che un cane non sia infetto.

Dal punto di vista diagnostico diretto (evidenziazione del parassita) od indiretto (risposta anticorpale o cellulo-mediata) possono essere impiegati alcuni test.

Esame Citologico (Metodo Diretto)

L’esame citologico permette di evidenziare gli amastigoti (fagocitati da neutrofili/macrofagi o extracellulari) in differenti organi o tessuti che possono o meno andare incontro anche ad una risposta infiammatoria. Tale tecnica possiede ovviamente un elevatissima specificità, ma una sensibilità nettamente inferiore (secondo alcuni studi tra il 30 ed il 50%, per linfonodi e midollo osseo rispettivamente) specie nelle fasi finali della malattia o in pazienti in terapia.

A questo proposito è opportuno ricordare come si debba considerare un’infezione “attiva” (cane “malato”) solo quando al rilievo citologico degli amastigoti si associ una riposta infiammatoria o reattiva (ad esempio iperplasia linfonodale plasmacellulare o linfadenite macrofagica). Infatti, in soggetti che vivono in aree endemiche possono identificarsi amastigoti in organo o tessuti normali, privi pertanto di lesioni.

In cani affetti da Leishmaniosi in tutti questi tessuti è possibile ritrovare nel campione citologici gli amastigoti di Leishmania i., fagocitati da macrofagi o liberi nello spazio extracellulare.

A questo proposito, gli organi o tessuti in cui più facilmente può annidarsi il parassita, anche in assenza di sintomatologia specifica, sono, in ordine decrescente di sensibilità: midollo osseo, linfonodi, milza e buffy coat. Di contro, in soggetti con sintomatologia potenzialmente ascrivibile a leishmania, il rilievo citologico di amastigoti permette di considerare il soggetto “infetto” indipendentemente dal titolo anticorpale.

Il materiale raccolto viene deposto su un apposito vetrino dove viene “strisciato” in modo da ottenere un monostrato di cellule.

Occorre infine sottolineare come in caso di riscontro di alterazioni citologiche riferibili a leishmaniosi, ma in assenza di visualizzazione di amastigoti, non si possa escludere comunque leishmaniosi e siano consigliabili ulteriori approfondimenti diagnostici dotai di maggiore “sensibilità”, quali ad esempio PCR.

PCR - Polimerase Chain Reaction (Metodo Diretto)

Rappresenta metodo estremamente sensibile che permette di identificare il DNA del kinetoplasto. Vengono impiegate PCR tradizionali e “quantitative” che, a differenza delle tecniche “tradizionali”, possono essere utilizzate per monitorare la terapia ed in sede di follow-up, quantificando il numero di parassiti.

Può essere condotta su animali asintomatici al fine di valutare l’eventuale stato di “infezione”. In tal caso gli organo più “sensibili”sono rappresentati da midollo osseo e linfonodi.

Minore sensibilità per ricerche eseguite su buffy coat, sangue intero, cute e congiuntiva.
Può essere condotta su animali sintomatici, nel caso in cui le altre tecniche di identificazione diretta (citologia, istologia, immunoistochimica) non abbiano fornito risultati soddisfacenti e conclusivi.

Le tecniche classicamente utilizzabili sono la “nested PCR” più sensibile rispetto ai metodi convenzionali (seppure soggetta a possibili contaminazioni e, di conseguenza, a possibili falsi positivi) e la PCR quantitativa (real-time PCR), anch’essa altamente sensibile ed estremamente utile nell’ambito del monitoraggio del paziente in terapia.

SIEROLOGIA (Metodo Indiretto - Ricerca IgG)

Occorre innanzitutto ricordare come titoli anticorpali risultano elevati - o tendono ad incrementare con il tempo - solo in quegli animali in cui si verifica disseminazione del parassita nell’organismo.

I più comuni test sierologici sono rappresentati da Immunofluorescenza (IF), ELISA, Immunocromatografia (IC).

IF ed ELISA posseggono elevatissima specificità (circa 100%) ed elevata sensibilità (da 70 a 100%). IF è considerato il metodo diagnostico di riferimento. ELISA è automatizzabile, oggettivo, e non risente pertanto della lettura di un operatore.

IC possiede specificità sovrapponibile a quella dei test precedenti, ma sensibilità molto inferiore (30 - 70%). Sono pertanto possibili con questi test dei falsi negativi. Inoltre con questi test “rapidi” non si può definire un “titolo” anticorpale, a differenza di quanto è fattibile con i test precedenti.

Occorre ricordare come in un soggetto “infetto” la risposta anticorpale (sieroconversione) possa verificarsi in un periodo variabile tra 1 e 22 mesi. Risulta pertanto possibile riscontrare falsi negativi specie nella fase iniziale dell’infezione.

La risposta anticorpale può essere valutata, per esempio, per monitorare un soggetto che proviene o ha soggiornato in zone endemiche, per valutare l’evoluzione della malattia in cani con sintomi clinici (maggior parte dei segni clinici legati alla produzione di anticorpi), per valutare la presenza di una risposta anticorpale in animali asintomatici (stato di infezione) che vivono in aree endemiche, al fine di decidere se proseguire con ulteriori approfondimenti diagnostici.

A questo proposito si ricorda ancora come titoli anticorpali medio - bassi in un soggetto che vive in area endemica, non permettono di classificare il cane come “malato”: potrebbe infatti semplicemente essere stato ”esposto” sviluppando pertanto anticorpi anti-leishmania.

VALUTAZIONE della RISPOSTA CELLULO-MEDIATA (Metodo Indiretto)

In teoria permette di valutare la resistenza dell’ospite al parassita. Infatti la resistenza all’infezione è conseguenza della risposta cellulo-mediata. In pratica, informazione relative a questo tipo di riposta possono essere ottenute mediante la valutazione del rapporto CD4/CD8 dei linfociti T (normale in cani con buona risposta cellulo-mediata e basso in cani con risposta prevalentemente umorale, non protettiva). Tale valutazione non incontra peraltro pareri unanimi relativi alla reale utilità.

Trattamento

Determinare lo stadio clinico dei cani è importante per definire se somministrare o non somministrare il trattamento. I cani esposti ed i cani infetti non ricevono alcun trattamento.

Il trattamento della leishmaniosi viene prescritto solo nei cani malati. Il protocollo terapeutico di prima scelta è rappresentato dall’associazione di antimoniato di N-metilglucammina ed allopurinolo; il primo è somministrato per via iniettabile ed il secondo per via orale. In alternativa, può essere somministrata l’associazione di miltefosina ed allopurinolo, entrambi somministrati per via orale. Con i farmaci indicati, i benefici si osservano generalmente entro 30-60 giorni dall’inizio.

Nei cani malati possono rendersi necessari altri farmaci, in aggiunta a quelli sopraindicati, in base al tipo e gravità delle manifestazioni cliniche. Per esempio, alcuni cani con grave zoppia indotta dalla leishmaniosi beneficiano di farmaci antiinfiammatori. Trattamenti ad uso topico sono invece necessari per alcune lesioni oculari e dermatologiche secondarie alla leishmaniosi. In alcuni cani con insufficienza renale rapidamente progressiva sono necessari trattamenti dialitici o di plasmaferesi. La dialisi permette di pulire il sangue dalle tossine, sostenendo il cane nell’attesa del miglioramento della funzionalità renale.