Amniocentesi: Scopri la Verità sui Falsi Positivi e Falsi Negativi!

L'amniocentesi è una procedura diagnostica prenatale che prevede il prelievo di liquido amniotico per analizzare il cariotipo fetale, esaminare il DNA fetale e ricercare eventuali agenti infettivi. L’amniocentesi presenta indicazioni che possono essere differenti a seconda dell’epoca di gravidanza nella quale la si esegue.

Indicazioni e Tempi di Esecuzione

La sempre maggiore richiesta di ottenere risposte citogenetiche precoci ha indotto, negli ultimi anni, ad eseguire il prelievo del liquido amniotico sempre più precocemente. Il periodo di gestazione indicato per questo esame è tra la 15^ e la 20^ settimana. Tuttavia vi sono situazioni specifiche in cui è possibile effettuarla anche in epoca più precoce (tra le 10 e le 14 settimane) o anche più tardivamente (dopo le 24 settimane).

Generalmente viene consigliata in presenza di alcuni fattori di rischio, come:

Età materna avanzata (> 35 anni)
Presenza di un assetto cromosomico particolare in uno o in ambedue i genitori
Precedente figlio con malattia cromosomica
Malformazioni fetali rilevate all'esame ecografico
Test di screening (es. test combinato) che indichi un rischio elevato per trisomia 21 o altra anomalia
Consulenza genetica che suggerisca l'effettuazione dell'esame

Amniocentesi Precoce

Ciò anche in relazione alla possibilità che il prelievo del liquido amniotico in epoca inferiore alla 15a settimana di gestazione si ponesse come una valida alternativa al prelievo dei villi coriali. Si ritiene comunque che i rischi associati all’amniocentesi diminuiscano dopo le 15 settimane di gravidanza, e che nei casi in cui sia necessario ricorrere a un’amniocentesi precoce, il quantitativo di liquido amniotico estratto sarà minore rispetto a quello prelevato nel periodo gestazionale generalmente consigliato.

Tale procedura, almeno agli inizi della sua introduzione clinica, era gravata da un maggior rischio abortivo ed è tutt’ora innegabilmente caratterizzata da una più alta incidenza di insuccessi diagnostici, o per mancata coltura o per errori di genere tecnico. In merito al rischio specifico, la letteratura ritiene che per le amniocentesi eseguite intorno alla 14^ settimana il rischio abortivo è sovrapponibile a quello delle amniocentesi della 17^ settimana.

Amniocentesi Tradizionale

L’amniocentesi eseguita tra la 16^ e la 18^ settimana rappresenta a tutt’oggi la metodica più frequentemente utilizzata ai fini diagnostici di citogenetica prenatale.

Per quel che concerne il materiale prelevato, la coltura abbisogna di una sufficiente cellularità; la quantità minima di liquido richiestoci, non deve essere inferiore ai 10 ml.

Rischi dell'Amniocentesi

I rischi dell’amniocentesi sono legati all’inserimento dell’ago e si possono classificare in rischi materni e rischi fetali. I rischi materni sono prevalentemente quelli associati a complicanze infettive o lesioni di organi interni. I rischi fetali sono l'aborto e/o complicanze della gravidanza che presentano una incidenza dell'0,5 -1 % circa.

Di tale percentuale si deve tener conto quando si valuta il rischio/beneficio della procedura diagnostica. Il rischio abortivo va infatti comparato con le percentuali di anormalità cromosomiche per l’età.

Accuratezza Diagnostica e Limiti

L'accuratezza diagnostica nell'analisi del cariotipo fetale è molto elevata, ma esistono dei limiti di risoluzione. Con l’esame standard vengono messe in evidenza con chiarezza sia le aneuploidie che le alterazioni strutturali di una certa entità. Cioè sono evidenziabili con l’esame standard solo le anomalie strutturali più grandi di 10-15 Mb con una risoluzione di bandeggio di 350-400 bande.

Possibili Errori e Artefatti

Va inoltre considerato che la percentuale di anomalie riscontrate nelle procedure è sempre maggiore rispetto alla nascita. Tra le metodiche più precoci, sono caratterizzate da un maggior numero di riscontri patologici. Ciò è dovuto ad una selezione naturale operante durante la gravidanza per i feti patologici.

La seconda è dovuta alla possibile contaminazione del liquido amniotico con materiale materno. Tale errore, secondo alcuni studi, avviene molto raramente (0.3%) se si ha l’accortezza di gettare le prime gocce di liquido che fuoriescono dall’ago.

La terza è il riscontro di aberrazioni cromosomiche generantesi in vitro, durante la coltura, note come pseudomosaicismi. Errori ed artefatti a parte, c’è la possibilità che le sole cellule del liquido amniotico siano portatrici di un vero mosaicismo assente poi negli altri tessuti fetali. Tale casualità, molto frequente nei villi coriali, risulta estremamente poco probabile negli amniociti.

Possibilità di artefatti "in vitro": Questo può avvenire infatti dal 2% al 3% delle colture. Tra le altre si verificano più frequentemente poliploidie. Il cromosoma 20, per esempio, è uno dei cinque cromosomi più frequentemente coinvolti in pseudomosaicismi. L'origine delle cellule è probabilmente extraembrionaria ed il mosaicismo, in tali casi, non è ovviamente presente nei tessuti fetali.

Insuccesso della Coltura

È possibile che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente. Questa evenienza è rara nel caso di liquido amniotico (avviene in 1 caso su 500). In caso di mancata crescita della coltura cellulare, la paziente viene contattata immediatamente.

Rischio Interpretativo

L'analisi citogenetica delle cellule del liquido amniotico riflette nel 99% dei casi il patrimonio cromosomico del feto, ed identifica il corrispondente fenotipo, ma ci sono dei casi in cui traslocazioni o mosaicismi rendono difficile la definizione fenotipica.

Necessità di Approfondimenti Diagnostici

In alcuni casi si riscontrano anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l'espressività fenotipica. L'indagine sui genitori è di grande ausilio poiché, spesso, si riscontra la stessa anomalia in uno di essi. Qualora ci si trovasse, invece, di fronte ad una mutazione "de novo" avvenuta nel feto, è necessario un approfondimento diagnostico mediante tecnica array-CGH (cariotipo molecolare), al fine di stabilire se nella traslocazione o inversione vi sia stata perdita (delezione) o guadagno (duplicazione) di materiale genetico.

Per quel che concerne le numerose alterazioni che si associano ai cromosomi sessuali ( es. 45,x ; 47,xxx ; 47,xxy ; ecc) i genitori vanno informati che il più delle volte sono compatibili con un fenotipo perfettamente normale.

Falsi Positivi e Falsi Negativi

La possibile discrepanza tra l’assetto cromosomico dei villi coriali e il cariotipo fetale con la possibilità di falsi positivi o falsi negativi. I falsi positivi (l’incidenza riportata in ampie casistiche è 1%) sono segnalati soprattutto quando viene utilizzata la sola tecnica diretta e sono controllabili sulla coltura o eventualmente sul liquido amniotico nel secondo trimestre.

Il mosaicismo (la presenza cioè di due linee cellulari con differente assetto cromosomico all’interno dello stesso individuo): le cellule dei villi coriali presentano la caratteristica di essere portatrici di mosaicismi veri e propri che poi, al controllo, non sono presenti nei feti. Tale mosaicismo viene riscontrato nell’1% dei campioni prelevati. In caso di mosaicismo la cromosomopatia potrebbe coinvolgere il feto o essere confinata solamente agli annessi extra-embrionari, occorre perciò estendere l’indagine ad altri tessuti fetali (es. liquido amniotico o sangue) per chiarirne il significato clinico.

Insorgenza di aberrazioni "in vitro": la maggior parte delle aberrazioni cromosomiche riscontrate nelle villocentesi sono da riferirsi a pseudomosaicismi. Con tale termine si intende la presenza di un cromosoma extranumerario presente solo nei villi ma del tutto assente nel feto. Questi, ovviamente, non hanno significato clinico. Per stabilire che si tratta di tale artefatto, il genetista esperto si basa essenzialmente sulle seguenti due considerazioni. La prima è che la cellula aberrante è solitamente unica quando ci si trova a leggere un allestimento diretto e, in coltura, l’alterazione interessa pertanto un unico clone di crescita. In tal modo nelle cellule coltivate l’aberrazione appartiene sempre a zone isolate di una stessa flasca. La seconda considerazione è che, solitamente, ci si trova di fronte a mosaicismi che non sono compatibili con la vita e che, pertanto, sono da considerare assolutamente come errori di coltura.

Amniocentesi vs. DNA Fetale (NIPT)

Non esiste una scelta migliore di un’altra in senso assoluto tra amniocentesi e DNA fetale. La differenza sostanziale è che il DNA Fetale non è un test diagnostico, e che dunque definisce solo su base probabilistica la presenza nel feto delle più comuni anomalie cromosomiche. Va detto, però, che questo esame ha una specificità e sensibilità superiori rispetto agli altri test di screening non invasivi; cioè la probabilità di un falso negativo (ossia che non venga rilevata un’anomalia genetica) è inferiore all’1%, e la probabilità di un falso positivo (cioè che venga rilevata un’anomalia genetica che in realtà non c’è) è inferiore allo 0,1%.

Il NIPT (Non Invasive Prenatal Testing) è costituito da un prelievo di sangue materno nel quale, attraverso indagini molecolari, viene ricercato DNA fetale.Il DNA fetale, DI ORIGINE PLACENTARE, nel sangue materno, è rintracciabile a partire dalla 10° settimana di gravidanza. Il DNA fetale presente nel campione ematico prelevato non deve essere inferiore al 4%. Se fosse inferiore al 4%, e questo avviene nel 2% dei casi, l’analisi dei cromosomi fetali non è possibile.

La tabella seguente riassume le principali differenze tra amniocentesi e NIPT:

Caratteristica	Amniocentesi	NIPT (DNA Fetale)
Tipo di test	Diagnostico	Screening
Invasività	Invasivo	Non invasivo
Rischio di aborto	0.5-1%	Nullo
Accuratezza	Elevata	Alta (ma non diagnostica)
Tempo di esecuzione	15^-20^ settimana	Dalla 10^ settimana
Costo	Gratuito (con indicazioni mediche), a pagamento (senza indicazioni)	A pagamento

Altre Valutazioni nel Liquido Amniotico

Nel liquido amniotico si è usi valutare anche la quantità di alfa-feto-proteina (AFP). Tale sostanza, individuata negli anni ’50 in alte percentuali, incontrò l’interesse degli ostetrici quando ci si avvide dell’aumento della sua presenza nel compartimento materno in relazione a differenti problemi fetali ed in particolare a difetti del tubo neurale: anencefalia, spina bifida aperta, gastroschisi ed onfalocele ed altri difetti “aperti” del tronco fetale.

Sempre nel secondo trimestre di gravidanza accade di dover diagnosticare la presenza di eventuali malattie infettive. L’introduzione delle metodiche di amplificazioni genica ed in particolare della reazione a catena della polimerasi (PCR), permette oggi di riconoscere, amplificandole, anche piccole sequenze di materiale genomico dell’agente infettivo.

L’esistenza di un’infezione endoamniotica è anche causa di diverse patologie che possono impedire un buon svolgimento della gravidanza. Per questo, infatti, sta prendendo sempre più piede la ricerca sul liquido amniotico di alcune sostanze mediatrici della flogosi quali le CITOCHINE. In particolare e la ricerca dell’INTERLEUCHINA-6 sul liquido amniotico presenta una straordinaria efficacia della diagnosi predittiva di numerose patologie del feto in utero.