Scopri il Segreto della Processazione di un Campione Istologico: Guida Completa dalla Raccolta all'Osservazione Microscopica

L’allestimento di preparati microscopici implica una serie di operazioni che consistono in: prelievo di frammenti d’organo, fissazione, inclusione e colorazione.

1. Prelievo del Campione

Il prelievo di frammenti d’organo va condotto al più presto sul materiale fresco. Nell'ambito della medicina, per poter condurre la sua osservazione e dunque la sua analisi, l'istologo necessita di una piccola porzione d'organo. Quest'utlima viene, tipicamente, escissa dalla figura professionale del chirurgo di una struttura pubblica o privata in corso di una seduta operatoria, con il quale l'istologo collabora.

Se, in teoria, i metodi di osservazione delle cellule allo stato vitale sarebbero da preferirsi in quanto consentono uno studio dinamico della cellula, in assenza di artefatti di immagine prodotti dalle fasi successive di allestimento del campione, in realtà il loro impiego è limitato perché le cellule ed i tessuti isolati dall’organismo non sopravvivono che per tempi brevi (a meno che non siano coltivati in vitro) in quanto gli enzimi litici intracellulari si attivano rapidamente e distruggono la cellula (autolisi) provocando gravi alterazioni di struttura.

In secondo luogo, frammenti spessi di tessuto non permettono un’analisi citologica fine e quindi diventa necessario lavorare con tessuti uccisi chimicamente, prima che intervengano gli enzimi autolitici, e tagliarli in sezioni sottili che possano essere osservate al microscopio, eventualmente previa colorazione.

2. Fissazione

La fissazione consiste nel trattamento del frammento d’organo con procedimenti chimici o fisici capaci di preservare e stabilizzare i costituenti dei tessuti, inattivando nel contempo gli enzimi autolitici. Per questi motivi, è necessario fissare il campione bioptico, preferibilemnte subito dopo il prelievo, cioè trattarlo in maniera fisica o chimica per interrompere i processi autolitici prima citati, per conservare la forma cellulare e per ottenere un'"istantanea" delle cellule senza che subentrino nuove modificazioni della loro struttura interna. Più è rapida la fissazione, più la struttura cellulare viene conservata nella configurazione più simile a quella in vivo.

La fissazione dura da pochi minuti fino a 24-48 ore a seconda della grandezza del frammento. Il rapporto fissativo/campione deve essere di 20:1. La fissazione di organi interi non è in genere buona norma, in quanto, a parte l’impossibilità di alcune situazioni, la penetrazione lenta del liquido ha l’inconveniente di permettere l’autolisi delle parti che tardivamente vengono a contatto col fissativo.

Ogni fissativo all’atto di provvedere alla stabilizzazione delle strutture provoca degli artefatti di struttura, ossia immagini inesistenti prima della fissazione. Ciò comporta che il metodo venga di volta in volta scelto opportunamente in rapporto al tipo di strutture che si desiderano studiare e, di conseguenza, alla colorazione da adottare. Nella scelta di un fissativo va anche tenuto presente che esso non deve svolgere azione estrattiva sui componenti che si desiderano identificare.

Così, ad esempio, i fissativi in soluzione acquosa sono controindicati quando si debba studiare la distribuzione del glicogeno, in quanto tale sostanza è solubile in acqua. In questa evenienza è indispensabile l’uso dell’alcool etilico assoluto che precipita il glicogeno. I fissativi maggiormente usati sono la formaldeide (o formalina) al 10% e l’alcool etilico a 90°. Soprattutto la prima viene particolarmente raccomandata in quanto consente la realizzazione dei più comuni metodi di colorazione per uso diagnostico.

È maggiormente usata la formalina tamponata per evitare variazioni di pH che possano alterare le proprietà antigeniche di alcuni antigeni. L’aldeide formica ha un forte odore e per evitare danni all’apparato respiratorio conseguenti alla sua inalazione, si devono usare cappe o almeno tenere aperte le finestre. È cancerogena per le vie respiratorie e teratogena, cioè danneggia il feto nel 1° trimestre di gravidanza.

Non bisogna mai usare la soluzione fisiologica in quanto l’acqua entrerebbe nelle cellule per osmosi facendole scoppiare. Altri fissativi sono: gluteraldeide, cloruro di mercurio, acido picrico. I migliori fissativi sono quelli che determinano una precipitazione dei componenti cellulari in minutissimi granuli. I fissativi contenenti acidi (come l’acido picrico) sono molto penetranti e molto rapidi, ma determinano l’addensamento della struttura nucleare.

Bisogna considerare che nel caso si vogliano effettuare studi immunoistochimici, la formalina richiede successive tecniche di smascheramento antigenico in quanto questo fissativo crea ponti metilenici con le proteine alterandone la struttura. La formaldeide non permette di scendere all’individuazione di fini dettagli citologici, dato che le cellule vanno incontro a raggrinzamenti e retrazioni. Ne consegue che per indagini analitiche si consigliano altri fissativi o, meglio, miscele di fissativi.

Alcuni fissativi fungono anche da coloranti come nel caso dell’acido osmico, usato per la dimostrazione dei lipidi. Una tecnica di fissazione molto utilizzata è il congelamento-essiccamento: si ricopre il materiale da fissare con una resina e lo si espone a vapori di azoto liquido alla temperatura di -170 - -190 °C, completando l’operazione a -30 - -40 °C. Questa tecnica ha il vantaggio di una rapida fissazione e non necessita di una successiva fase di smascheramento antigenico se si vogliono usare tecniche immunoistochimiche.

Per fissare il tessuto, infine, spesso si usano miscele di varie sostanze; le più note sono: miscela di Bouin, di Zenker, di Susa, di Carnoy e di Orth.

La così detta fissazione fisica è una metodica che prevede il rapido congelamento del campione tramite vapori di azoto liquido (quest'ultimo si trova ad una temperatura di circa -196 °C), previo trattamento del campione con un gel crioprotettore. La fissazione chimica, invece, prevede l'uso di sostanze chimiche che, penentrando nel campione immerso al loro interno in maniera centripeta, inibiscono le proteine enzimatiche che partecipano ai processi di autodigestione, bloccandoli.

La formaldeide è una molecola gassosa a temperatura ambiente, dall’odore pungente ed altamente solubile in acqua: la soluzione così ottenuta prende il nome di formalina. La formalina neutra tamponata al 10% rappresenta il fissativo per eccellenza poiché mantiene inalterata la morfologia cellulare e l’architettura dei tessuti, oltre a conservare in maniera soddisfacente l’antigenicità di cellule ed agenti eziologici, bloccando i fenomeni di autolisi.

Linee guida nazionali raccomandano l’utilizzo di formalina tamponata per prevenire l’acidificazione causata dalla capacità dell’acido formico di ossidarsi: è necessario utilizzare formalina tamponata per evitare variazioni di PH che possono alterare le proprietà antigeniche, che renderebbero difficoltose ad esempio le procedure immuno-istochimiche. La formalina penetra nei tessuti ad una velocità di circa 1mm/h: per tale ragione, i campioni di grandi dimensioni necessitano una fissazione prolungata; inoltre è consigliabile eseguire delle incisioni parallele e non compete, che facilitino la penetrazione del fissativo.

Per la fissazione e la conservazione dei campioni, è necessario utilizzare quindi contenitori a bocca larga e capienti: si ricordi che dopo l’immersione in formalina il campione, fissandosi, tenderà ad irrigidirsi. L’utilizzo di contenitori dalla bocca stretta provocherebbe problemi durante la fase di estrazione del campione dal contenitore. Come già specificato, non è sufficiente diluire la formalina con acqua, soprattutto se non deionizzata.

Se si volesse preparare la soluzione in casa sono necessari oltre alla formaldeide al 40%, acqua deionizzata, sodio fosfato monosodico e bisodico necessari per la conservazione del PH (7,2-7,3). Per questo è assolutamente consigliabile acquistare soluzioni di formalina al 10% neutra tamponata pronta all’uso. Essendo inoltre molecola volatile, tende ad evaporare facilmente, compromettendo la sicurezza dell’operatore che la sta preparando, trattandosi di un agente chimico pericoloso (irritante, caustico e cangerogeno).

Ad oggi non è ancora disponibile una valida alternativa alla formalina come fissativo dei campioni istologici: questa risulta quindi ancora indispensabile nei laboratori di anatomia patologica. Quello su cui si può intervenire è la riduzione dell’esposizione del personale a tale sostanza, mediante l’uso di contenitori pre-riempiti che annullano quasi totalmente l’esposizione diretta, l’utilizzo di cappe aspiranti nei laboratori di patologia e l’utilizzo di dispositivi di sicurezza individuali.

3. Disidratazione e Diafanizzazione

Terminata la fissazione, il campione deve essere disidratato, cioè tutta l'acqua contenute nelle sue cellule deve essere allontanata perchè solo così si potrà procedere alla fase dell'inclusione. La disidratazione del campione istologico si ottiene immergendo quest'ultimo in soluzioni idroalcoliche a concentrazioni crescenti, tipicamente secondo questa scala: acqua distillata - alcol 70% - alcol 95% - alcol 100%.

Dopo che tutta l'acqua delle cellule è stata sostituita con l'alcol 100%, è necessario diafanizzare il campione, cioè immergerlo in una sostanza chimica che ha la caratteristica di essere miscibile sia con gli alcoli che con le molecole usate per l'inclusione (quindi, il diafanizzante rappresenta un prodotto di transizione che permette di preparare il campione alle fasi successive) e che ha l'obiettivo di rendere trasparente il campione così che potrà essere attraversato con più facilità dal fascio luminoso del microscopio. Il tipico diafanizzante usato in Istologia è lo xilene, ormai sostituito da suoi analoghi perchè meno tossici.

4. Inclusione

L’inclusione consiste nel lasciar permeare il tessuto da una sostanza che solidifica a temperatura ambiente atta a consentire il taglio in sezioni sottili dello spessore di pochi micron. Avendo rimosso tutta l'acqua dalle cellule del campione e avendola sostituta totalmente con il diafanizzante, è possibile procedere alla fase dell'inclusione, il cui scopo è quello di indurire il campione (spesso, infatti, si tratta di campioni di tessuto molle) e soprattutto di includerlo all'interno di un supporto/mezzo rigido che potrà essere, poi, tagliato per ottenere delle sezioni estremamente sottili.

Essa è correntemente rappresentata dalla paraffina. Trattandosi di una sostanza idrofoba, la sua penetrazione richiede che dal tessuto venga allontanata l’acqua a mezzo di un disidratante. Si usa all’uopo una serie di soluzioni di alcool etilico a gradazione crescente fino a portare il pezzo in alcool assoluto. Da qui il tessuto viene trasferito in un solvente della paraffina che di solito è lo xilolo. Esso ha la funzione di consentire la penetrazione del mezzo includente.

La paraffina, il cui punto di fusione varia tra 52 e 60 °C, è usata allo stato liquido, quindi l’operazione viene praticata in termostato. Una volta che la compenetrazione è avvenuta, il pezzo viene rapidamente raffreddato, così da acquistare la consistenza della paraffina solida. Un’inclusione in un materiale più duro può essere ottenuta utilizzando plastiche quali resina epossidica.

L'infiltrazione del frammento da includere viene fatta con plastica allo stato momomerico nel quale essa è fluida; viene quindi indotta la solidificazione del frammento infiltrato facendo polimerizzare la plastica mediante calore o raggi ultravioletti. Trattandosi di un materiale di inclusione molto duro, la plastica consente di ottenere sezioni sottili dello spessore di poche centinaia di nanometri che possono essere osservate al microscopio elettronico.

Nel caso di organi i cui componenti abbiano consistenza disomogenea, come il nevrasse e l’osso, si preferisce l’inclusione in celloidina o in resina. Solo nel caso di tessuti calcificati all’inclusione viene fatta precedere la decalcificazione, per la quale si ricorre all’uso di acidi diluiti ovvero di chelanti, come l’acido tetracetico dell’etilendiamina (EDTA). Vi sono poi eventualità nelle quali non è possibile l’uso dell’inclusione, per esempio quella in cui si vogliano studiare i grassi neutri, i quali sono solubili in alcool ed in xilolo.

Si ricorre in tal caso all’uso del microtomo congelatore. Con questo strumento si conferisce al pezzo la durezza necessaria per essere sezionato a mezzo del congelamento estemporaneo con neve carbonica. Trova anche largo impiego il criostato che consta di una camera termicamente isolata entro la quale è collocato il microtomo.

In microscopia ottica si utilizza la paraffina per includere i tessuti. La paraffina è una cera a base di idrocarburi alifatici, in particolare alcani, che può impregnare il campione immerso al suo interno in maniera centripeta allontanando il diafanizzante e prendendo il suo posto. La paraffina è una sostanza apolare, motivo per il quale non avrebbe potuto penetrare nel campione se le cellule di quest'ultimo avessero contenuto ancora acqua, la quale invece è polare. Alla fine del processo, ne risulterà un cubetto bianco di paraffina solida e dura, al centro del quale è "bloccato"/"incastrato" il campione.

5. Taglio

Del tessuto incluso si ottengono fette di 3-10 µm, usando un microtomo a lama d’acciaio. Data la sottigliezza, queste risultano difficilmente maneggevoli, quindi vengono montate su un vetrino portaoggetto. In microscopia ottica, la fase del taglio prevede l'utilizzo di uno strumento di laboratorio chiamato microtomo, più comunemente della sua variante rotativa (microtomo rotativo).

Si tratta di uno strumento sul cui modulo portacampione viene montato il cubo di paraffina orientato secondo quanto necessario e nel cui modulo portalama viene inserita una lama molto simile ad un rasoio manuale. Girando la manopola dello strumento, il modulo portacampione comincia a mouversi in verticale, dall'alto in basso e viceversa, e in avanti, avvicinando progressivamente la faccia del cubetto di paraffina alla lama di una distanza impostata dall'operatore. Tale distanza corrispondere allo spessore delle sezioni di campione che si vogliono ottenere: lo spessore ideale in microscopia ottica è di 5-7 micrometri.

Le varie sezioni che via via si ottengono dal taglio al microtomo corrispondono ad un'intera faccia del cubo di paraffina, dunque la porzione periferica di tali sezioni sarà sola paraffina che non contiene materiale utile (il campione, infatti, si trova posto centralmente). Le sezioni vengono, così, portate delicatamente sulla superficie dell'acqua posta all'interno di un bagnetto riscaldato a 37 °C (bagno stendifette): tale operazione ha lo scopo di favorire la distensione delle sezioni e di ammorbidire la paraffina, nonchè di poterle raccogliere su vetrino.

Infatti, una volta che le sezioni sono ben distese sulla superficie dell'acqua, vengono raccolte con il vetrino porta-oggetti facendole aderire all'estermità del vetrino stesso. Tale adesione è spontanea e non richiede particolari accorgimenti. Quella appena descrittà è la così detta "tecnica delle fette". In microscopia elettronica, invece, si fa uso di uno strumento che prende il nome di ultramicrotomo, il quale consente di ottenere sezioni spesse qualche decina o centinaio di nanometri.

6. Sparaffinatura e Idratazione

Per provvedere alla loro colorazione si suole allontanare la paraffina e riportare il tessuto al suo primitivo stato d’idratazione. Così le sezioni vengono dapprima immerse in xilolo, quindi in una serie di soluzioni di alcool a gradazione decrescente fino all’acqua.

Le fasi di sparaffinatura ed idratazione sono fondamentali per poter concludere la preparazione del campione istologico e corrispondono semplicemente al rovescio delle fasi di disidratazione e diafanizzazione viste in precedenza: in tal caso, è necessario immergere le sezioni prima nel diafanizzante (xilene od analoghi) per sparaffinare e, poi, nella serie di soluzioni idroalcoliche a concentrazioni decrescenti (alcol 100% - alcol, 95% - alcol 70%), fino all'acqua distillata, per reidratare il campione.

La sparaffinatura è importante per rimuovere la paraffina periferica dalle sezioni che erano state raccolte su vetrino e per allontanare la paraffina che aveva impregnato le sezioni. Tale allontanamento permette, a sua volta, di far penetrare nelle cellule gli alcoli e far sostituire questi con sola acqua durante la reidratazione. In questo caso, la reidratazione ha l'obiettivo di permettere la fase successiva, cioè quella della colorazione, poichè la maggior parte dei coloranti utilizzati in istologia sono coloranti acquosi (non penetrerebbero nelle cellule se in queste vi rimanesse paraffina).

7. Colorazione

La colorazione viene praticata principalmente per mettere in risalto singoli componenti strutturali. In altri casi viene eseguita al fine di identificare costituenti chimici particolari del tessuto. Se il tessuto da esaminare consiste in un monostrato di cellule (per esempio cellule coltivate in vitro, preparati per striscio di sangue circolante o preparati per schiacciamento), esso viene di solito osservato direttamente al microscopio. Negli altri casi, invece, si procede con la colorazione.

Le cellule sono naturalmente trasparenti dato che sono costituite essenzialmente da acqua, motivo per il quale per poterle osservare al microscopio devono essere colorate artificialmente per generare un contrasto tra le loro diverse componenti. I coloranti sono di due tipi: naturali e sintetici. I primi possono essere di origine tanto animale che vegetale. I secondi, prodotti in laboratorio, sono derivati dall’anilina.

I coloranti, ancora, si distinguono in vitali e sopravitali. I coloranti vitali hanno la proprietà di essere assunti attivamente da alcune cellule viventi permettendo così la loro identificazione o lo studio di funzioni particolari. Esempi di coloranti vitali sono: Alizarina, Blu Triptan, Verde Janus, Rosso neutro e Blu di metilene.

I coloranti sopravitali, invece, sono somministrati a cellule o a tessuti isolati dall’organismo. I coloranti si legano ai tessuti mediante legami chimici con le proteine, gli acidi nucleici, le glicoproteine e le lipoproteine. Da un punto di vista chimico, quindi, i coloranti sono classificati in due categorie: coloranti acidi, nei quali il gruppo cromoforo è acido (anionico) e coloranti basici, nei quali il gruppo cromoforo è basico (cationico).

I coloranti acidi più comuni sono: eosina, arancio G, verde luce. I coloranti basici più comuni sono: blu di metilene, blu di toluidina, tionina, verde di metile, pironina, azzurro B, fucisina basica. I componenti dei tessuti che hanno affinità per i coloranti acidi sono detti acidofili; quelli che mostrano affinità per i coloranti basici sono detti basofili.

Bisogna considerare, però, che l’acidofilia e la basofilia dei vari costituenti cellulari dipendono dal pH della soluzione colorante. Ai valori di pH comunemente impiegati per una determinata colorazione istologica (pH = 6), la cromatina del nucleo, l’ergastoplasma, le mucoproteine e i glicosaminoglicani assumono i coloranti basici, mentre gli eritrociti, i granuli dei granulociti eosinofili ed alcune parti del citoplasma legano coloranti acidi.

I coloranti sono di regola indiretti in quanto la loro fissazione al tessuto necessita l’impiego di mordenzatori, ossia degli ossidanti (acido fosfomolibdico, acido picrico, acido fosfowolframico, acido cromico, permanganato di potassio, ecc.) che fungono da mezzo intermediario di collegamento tra struttura tissutale e colorante, fra i quali non esiste una particolare affinità. I metodi di colorazione prevedono spesso l’uso di più coloranti, ciascuno capace di mettere in evidenza un particolare componente strutturale.

In tal senso i singoli coloranti possono essere applicati successivamente ovvero contemporaneamente sotto forma di miscele bilanciate. I coloranti chimici vengono ulteriormente distinte in base al numero di coloranti che bisogna utilizzare, dunque si avranno colorazioni bicromiche con due coloranti, tricromiche con tre coloranti ecc... La colorazione in assoluto più utilizzata in istologia è la bicromica ematossilina-eosina, la quale sfrutta un colorante acido come l'eosina che colora il citoplasma di rosso/rosa e un colorante basico come l'ematossilina che colora i nuclei di blu-violetto: questi due coloranti, avendo proprietà acido-base diverse e, dunque, un'affinità diversa per diverse componenti della cellula (citoplasma/nucleo), permettono di creare il contrasto e di osservare con agilità il proprio campione.

8. Disidratazione (Post-Colorazione)

Ancora una volta si rende necessario disidratare il campione immergendo le sezioni in soluzioni alcoliche a concentrazioni crescenti, fino al diafanizzante (acqua distillata - alcol 70% - alcol 95% - alcol 100% - xilene o analoghi).

9. Montaggio

A questo punto si può procedere alla colorazione e al montaggio, ossia all’applicazione di un vetrino coprioggetto che viene fatto aderire al primo mediante una resina naturale o sintetica. L'ultima fase della preparazione del campione istologico è rappresentata dal così detto montaggio, operazione che consiste nel far colare una goccia di balsamo di montaggio (balsamo del Canadà o analoghi) in corrispondenza della sezione raccolta sul vetrino porta-oggetti ed adagiare delicatamente sullo stesso punto il vetrino copri-oggetto (vetrino più sottile e piccolo).

Solo al termine di tutte queste fasi, si potrà procedere all'osservazione e allo studio del proprio campione.