Preparazione di un Vetrino Istologico: Guida Completa e Protocollo Passo per Passo

L'Istologia è la branca della medicina che si occupa dello studio dei tessuti. Un tessuto è un insieme di cellule che hanno la stessa morfologia, la medesima funzione e la stessa derivazione embriologica. L'istologo esplora il mondo delle cellule per osservarne e descriverne tutte le caratteristiche, con un interesse crescente man mano che si aumenta il livello di dettaglio.

Il processo di preparazione del campione istologico permette di osservare il campione stesso al microscopio. Questo processo include diverse fasi, dal prelievo del campione di tessuto al montaggio sul vetrino, sfruttando sostanze chimiche apposite per la colorazione.

Fasi della Preparazione del Campione Istologico

Le fasi fondamentali per allestire un preparato istologico sono:

Prelievo
Fissazione
Inclusione
Sezionamento
Montaggio
Colorazione

Con le dovute differenze, le fasi elencate valgono anche anche per la microscopia elettronica.

1) Prelievo del Campione

Nell'ambito della medicina, l'istologo necessita di una piccola porzione d'organo per la sua analisi. Quest'ultima viene escissa dal chirurgo in corso di una seduta operatoria, con il quale l'istologo collabora. Prima di effettuare il prelievo, un organismo viene sacrificato o anestetizzato. In seguito, utilizzando lame affilatissime, si procede a prelevare campioni di determinati organi o tessuti da studiare.

2) Fissazione

Le cellule di un campione tissutale escisso vanno incontro ad un processo di autodegradazione dovuto all'interruzione del flusso di sangue e della diffusione di ossigeno, che le conduce rapidamente a morte. Tali processi autodigestivi alterano anche la loro morfologia (forma). Per questi motivi, è necessario fissare il campione bioptico, preferibilmente subito dopo il prelievo, cioè trattarlo in maniera fisica o chimica per interrompere i processi autolitici prima citati, per conservare la forma cellulare e per ottenere un'"istantanea" delle cellule senza che subentrino nuove modificazioni della loro struttura interna. Più è rapida la fissazione, più la struttura cellulare viene conservata nella configurazione più simile a quella in vivo.

La fissazione consiste nel trattamento del frammento d’organo con procedimenti chimici o fisici capaci di preservare e stabilizzare i costituenti dei tessuti, inattivando nel contempo gli enzimi autolitici.

La fissazione fisica prevede il rapido congelamento del campione tramite vapori di azoto liquido, previo trattamento del campione con un gel crioprotettore. La fissazione chimica prevede l'uso di sostanze chimiche che, penetrando nel campione immerso al loro interno in maniera centripeta, inibiscono le proteine enzimatiche che partecipano ai processi di autodigestione, bloccandoli.

I fissativi utilizzati si distinguono in fissativi fisici e fissativi chimici. La fissazione fisica può avvenire per rapido riscaldamento, in cui il campione viene essiccato eliminando l’acqua e denaturando la componente proteica, oppure tramite congelamento. Il congelamento prevede due metodi: il metodo del congelamento-essiccamento e congelamento-sostituzione.

La formalina neutra tamponata al 10% rappresenta il fissativo per eccellenza poiché mantiene inalterata la morfologia cellulare e l’architettura dei tessuti, oltre a conservare in maniera soddisfacente l’antigenicità di cellule ed agenti eziologici, bloccando i fenomeni di autolisi.

Linee guida nazionali raccomandano l’utilizzo di formalina tamponata per prevenire l’acidificazione causata dalla capacità dell’acido formico di ossidarsi: è necessario utilizzare formalina tamponata per evitare variazioni di PH che possono alterare le proprietà antigeniche, che renderebbero difficoltose ad esempio le procedure immuno-istochimiche.

La formalina penetra nei tessuti ad una velocità di circa 1mm/h: per tale ragione, i campioni di grandi dimensioni necessitano una fissazione prolungata; inoltre è consigliabile eseguire delle incisioni parallele e non compete, che facilitino la penetrazione del fissativo.

3) Disidratazione e Diafanizzazione

Terminata la fissazione, il campione deve essere disidratato, cioè tutta l'acqua contenute nelle sue cellule deve essere allontanata perchè solo così si potrà procedere alla fase dell'inclusione. La disidratazione del campione istologico si ottiene immergendo quest'ultimo in soluzioni idroalcoliche a concentrazioni crescenti, tipicamente secondo questa scala: acqua distillata - alcol 70% - alcol 95% - alcol 100%.

Dopo che tutta l'acqua delle cellule è stata sostituita con l'alcol 100%, è necessario diafanizzare il campione, cioè immergerlo in una sostanza chimica che ha la caratteristica di essere miscibile sia con gli alcoli che con le molecole usate per l'inclusione e che ha l'obiettivo di rendere trasparente il campione così che potrà essere attraversato con più facilità dal fascio luminoso del microscopio. Il tipico diafanizzante usato in Istologia è lo xilene, ormai sostituito da suoi analoghi perchè meno tossici.

4) Inclusione

Avendo rimosso tutta l'acqua dalle cellule del campione e avendola sostituta totalmente con il diafanizzante, è possibile procedere alla fase dell'inclusione, il cui scopo è quello di indurire il campione e soprattutto di includerlo all'interno di un supporto/mezzo rigido che potrà essere, poi, tagliato per ottenere delle sezioni estremamente sottili. In microscopia ottica si utilizza la paraffina per includere i tessuti. La paraffina è una cera a base di idrocarburi alifatici, in particolare alcani, che può impregnare il campione immerso al suo interno in maniera centripeta allontanando il diafanizzante e prendendo il suo posto.

I tessuti biologici prelevati hanno perso la loro consistenza, quindi devono essere inclusi all’interno di materiali più resistenti, in modo tale da acquisire una maggiore rigidità, ideale per il successivo sezionamento. L’inclusione non è necessaria se è avvenuta la fissazione fisica.

La paraffina è una miscela di idrocarburi alifatici ed è apolare, ossia non miscibile con l’acqua, quindi prima dell’inclusione è necessaria una disidratazione. Reso il campione apolare, esso è posto in paraffina fusa, il tutto viene poi colato in stampi metallici e fatto raffreddare a temperatura ambiente.

Alla fine del processo, ne risulterà un cubetto bianco di paraffina solida e dura, al centro del quale è "bloccato"/"incastrato" il campione.

5) Taglio (Sezionamento)

In microscopia ottica, la fase del taglio prevede l'utilizzo di uno strumento di laboratorio chiamato microtomo, più comunemente della sua variante rotativa (microtomo rotativo). Si tratta di uno strumento sul cui modulo portacampione viene montato il cubo di paraffina orientato secondo quanto necessario e nel cui modulo portalama viene inserita una lama molto simile ad un rasoio manuale.

Il blocchetto di paraffina ottenuto deve essere sezionato ricavando fette estremamente sottili, circa 5-7 µm , in modo tale che la luce possa attraversarle e, dopo la colorazione, siano ben visibili al microscopio.

Le sezioni vengono, così, portate delicatamente sulla superficie dell'acqua posta all'interno di un bagnetto riscaldato a 37 °C (bagno stendifette): tale operazione ha lo scopo di favorire la distensione delle sezioni e di ammorbidire la paraffina, nonchè di poterle raccogliere su vetrino. Infatti, una volta che le sezioni sono ben distese sulla superficie dell'acqua, vengono raccolte con il vetrino porta-oggetti facendole aderire all'estermità del vetrino stesso. Tale adesione è spontanea e non richiede particolari accorgimenti.

In microscopia elettronica, invece, si fa uso di uno strumento che prende il nome di ultramicrotomo, il quale consente di ottenere sezioni spesse qualche decina o centinaio di nanometri.

6) Sparaffinatura e Idratazione

Le fasi di sparaffinatura ed idratazione sono fondamentali per poter concludere la preparazione del campione istologico e corrispondono semplicemente al rovescio delle fasi di disidratazione e diafanizzazione viste in precedenza: in tal caso, è necessario immergere le sezioni prima nel diafanizzante (xilene od analoghi) per sparaffinare e, poi, nella serie di soluzioni idroalcoliche a concentrazioni decrescenti (alcol 100% - alcol, 95% - alcol 70%), fino all'acqua distillata, per reidratare il campione.

La sparaffinatura è importante per rimuovere la paraffina periferica dalle sezioni che erano state raccolte su vetrino e per allontanare la paraffina che aveva impregnato le sezioni. Tale allontanamento permette, a sua volta, di far penetrare nelle cellule gli alcoli e far sostituire questi con sola acqua durante la reidratazione. In questo caso, la reidratazione ha l'obiettivo di permettere la fase successiva, cioè quella della colorazione, poichè la maggior parte dei coloranti utilizzati in istologia sono coloranti acquosi (non penetrerebbero nelle cellule se in queste vi rimanesse paraffina).

7) Colorazione

Le cellule sono naturalmente trasparenti dato che sono costituite essenzialmente da acqua, motivo per il quale per poterle osservare al microscopio devono essere colorate artificialmente per generare un contrasto tra le loro diverse componenti.

Esistono due tipi principali di colorazioni:

Colorazioni fisiche: Si basano sull'impiego di coloranti che si sciolgono in determinate strutture del campione senza instaurare legami chimici con quest'ultime.
Colorazioni chimiche: Si basano sull'impiego di coloranti che instaurano legami chimici con le strutture del preparato, soprattutto in base alle loro proprietà ed affinità acido-base, o che per reazione danno un prodotto di nuova sintesi colorato e sarà quest'ultimo a legarsi alle strutture del preparato.

La colorazione in assoluto più utilizzata in istologia è la bicromica ematossilina-eosina, la quale sfrutta un colorante acido come l'eosina che colora il citoplasma di rosso/rosa e un colorante basico come l'ematossilina che colora i nuclei di blu-violetto: questi due coloranti, avendo proprietà acido-base diverse e, dunque, un'affinità diversa per diverse componenti della cellula (citoplasma/nucleo), permettono di creare il contrasto e di osservare con agilità il proprio campione.

8) Disidratazione (Post-Colorazione)

Ancora una volta si rende necessario disidratare il campione immergendo le sezioni in soluzioni alcoliche a concentrazioni crescenti, fino al diafanizzante (acqua distillata - alcol 70% - alcol 95% - alcol 100% - xilene o analoghi).

9) Montaggio ("Cover-Slipping")

L'ultima fase della preparazione del campione istologico è rappresentata dal così detto montaggio, operazione che consiste nel far colare una goccia di balsamo di montaggio (balsamo del Canadà o analoghi) in corrispondenza della sezione raccolta sul vetrino porta-oggetti ed adagiare delicatamente sullo stesso punto il vetrinocopri-oggetto (vetrino più sottile e piccolo).

Solo al termine di tutte queste fasi, si potrà procedere all'osservazione e allo studio del proprio campione.