L'amniocentesi e la villocentesi sono esami diagnostici prenatali invasivi utilizzati per individuare eventuali anomalie cromosomiche o genetiche nel feto.
Villocentesi
Quando Sottoporsi all'Esame
La villocentesi è indicata per lo studio di eventuali malattie geniche e per malattie dei cromosomi o dei geni entro i primi 3 mesi di gravidanza.
Normalmente, quindi, la villocentesi viene eseguita tra la 11a e la 13a settimana di gravidanza; quando necessario, può essere comunque realizzata in epoche successive.
Il vantaggio principale della villocentesi rispetto all'amniocentesi risiede nella possibilità di eseguire l'esame in epoca precoce, nonostante il prelievo del liquido amniotico sia oggi eseguibile anche tra la 11a e la 13a settimana (di regola si esegue tra la 15a e la 18a, quindi all'inizio del terzo trimestre di gravidanza).
Pertanto, in presenza di una grave patologia del feto, grazie alla villocentesi, la coppia può decidere di interrompere la gravidanza in epoca precoce, con minori stress fisici e psichici.
Tempi e Affidabilità dei Risultati
Informazioni preliminari sono disponibili dopo due o tre giorni dalla villocentesi, mentre per il referto definitivo è necessario attendere 10-15 giorni.
I diversi tempi di attesa riflettono due diverse tecniche analitiche del campione placentare, che ove possibile vengono sempre eseguite congiuntamente.
L'analisi cromosomica dev'essere eseguita su cellule in divisione e, nel caso dei villi coriali, si utilizzano due metodiche d'indagine: il metodo diretto per una diagnosi precoce ed una coltura cellulare per ottimizzare l'affidabilità diagnostica.
Si utilizzano due metodiche d'indagine: l'analisi diretta, l'altra per analisi dopo coltura.
Le cellule vengono seminate su un apposito vetrino ed incubate, in modo da favorirne la moltiplicazione ed originare le relative colonie (aggregati di cellule con lo stesso corredo cromosomico della cellula originaria).
Qualora la quantità sufficiente di villi coriali non è possibile l'allestimento di entrambi i preparati.
Tutto ciò diminuisce l'affidabilità diagnostica della villocentesi, perché il prelievo può essere contaminato da cellule d'origine materna; perciò, la coltura ha lo scopo di eliminare il rischio di analizzare cellule materne anziché fetali, con conseguente pericolo di falsi negativi.
In questo caso, a distanza di 2-4 settimane, può essere necessario ripetere la villocentesi, anche se nella maggior parte dei casi si opta per un prelievo del liquido amniotico.
Per contro, nonostante l'apparente assenza di anomalie, alla nascita il bambino potrebbe evidenziare difetti genetici non rilevabili tramite lo studio dei villi coriali.
Come anticipato, il rischio abortivo correlato alla villocentesi (1%) è molto simile a quello che grava sull'amniocentesi (0,5-1%).
Interpretazione dei Risultati della Villocentesi
Il referto della villocentesi può indicare diversi risultati:
- Aneuploidia rilevata: Indica che il test ha rilevato nel feto una aneuploidia a livello di uno (o più) dei cromosomi investigati (21, 18, 13, X o Y). Tale risultato indica che il feto presenta una delle condizioni cromosomiche indicate ma non assicura che il feto abbia tale condizione. Il follow-up consigliato è un test di diagnosi prenatale invasiva, come l'Amniocentesi.
- Assenza di aneuploidia: Indica che il test non ha rilevato la presenza di aneuploidie cromosomiche in uno dei cromosomi cromosomi esaminati.
- Risultato non ottimale o borderline: In alcuni casi il test potrebbe produrre un risultato non ottimale. In questo caso verrà richiesto alla gestante il prelievo di un nuovo campione ematico al fine di ripetere l’esame. In altri casi l’esame potrebbe fornire un risultato che indica un sospetto di presenza di aneuploidia cromosomica (risultato borderline).
Informazioni Importanti
Dopo la villocentesi si consigliano tre giorni di riposo. E’ consigliato di astenersi da attività fisica intensa (es. jogging o aerobica) per almeno uno o due giorni.
Pertanto, tre giorni prima dell’esame è consigliato l’utilizzo di un’antibiotico della famiglia dei macrolidi.
Amniocentesi
Quando Sottoporsi all'Esame
L'amniocentesi è più indicata per le coppie con rischio di malattie cromosomiche o per la diagnosi di infezioni fetali.
Si esegue tra la 15 e la 18 settimana per puntura trans addominale sotto guida ecografica, senza l’utilizzo di anestesia. Non è necessario il digiuno.
Tempi e Affidabilità dei Risultati
La risposta è disponibile in circa tre settimane (21 giorni).
L’esame può non dare risultato a causa di problemi tecnici relativi al prelievo o alla coltura cellulare (meno di 1% dei casi). Tale evento viene segnalato dopo circa 10-15 giorni. Eventualmente il prelievo potrebbe essere ripetuto.
E’ possibile richiedere indagini di diagnostica molecolare, che rilevano la presenza delle sindromi più diffuse come quella di Down, Edward e Patau, con referto urgente (entro 48 ore ).
Per quanto riguarda la Sindrome di Down, il test può dare errore diagnostico con probabilità inferiore a 1/1000.
In circa lo 0,3% dei casi il risultato citogenetico è tale da lasciare adito a dubbi interpretativi. In tali casi possono rendersi opportuni approfondimenti specifici.
Alfafetoproteina
Oltre al cariotipo il Ginecologo può richiedere un dosaggio di alfafetoproteina.
Informazioni Importanti
In pazienti sottoposte a terapie epariniche o con antiaggreganti piastrinici è suggerita la sospensione del farmaco 24 ore prima dell’esame.
Dopo l’amniocentesi si consigliano tre giorni di riposo. E’ consigliato di astenersi da attività fisica intensa (es.
Pertanto, tre giorni prima dell’esame è consigliato l’utilizzo di un’antibiotico della famiglia dei macrolidi.
Screening Biochimico (Duotest o Bitest)
Il BiTest viene eseguito al primo trimestre, tra le 11 e le 13 settimane di gestazione, quando il CRL (misura della lunghezza fetale, misurata tra il vertice del cranio e l’osso sacro) è compreso tra 45 e 84 mm. Se il CRL è inferiore a 45mm, verrà prenotato un altro appuntamento nella settimana successiva.
Il software per il calcolo del rischio di avere un feto affetto dalla sindrome di Down si basa su studi effettuati su oltre 100.000 pazienti, pubblicati dal gruppo di Professor K.
La translucenza nucale è lo spessore della cute del feto a livello del collo (vedi figura pag successiva) ed è presente in tutti i feti.
Negli ultimi anni numerosi lavori hanno dimostrato che la determinazione di alcuni parametri biochimici nel siero materno possono contribuire ad identificare le gravidanze a rischio abbastanza alto per la sindrome di Down e di altre patologie cromosomiche e che, diversamente dalla villocentesi o dall’amniocentesi, non presentano rischi per la gestante.
Sindrome di Down (Trisomia 21)
La Trisomia 21 o SINDROME DI DOWN è una delle principali anomalie cromosomiche ed è una delle principali cause di ritardo mentale e problemi fisici come difetti cardiaci o difficoltà di vista e udito.
La sindrome di Down è causata dalla presenza di un cromosoma 21 soprannumerario nelle cellule fetali.
In assenza dello screening, circa 1 bambino su 700 nasce con la Sindrome di Down.
Solitamente non è ereditaria e così un bambino può risultare affetto anche se non c’è una storia familiare di Sindrome di Down.
La frequenza delle anomalie cromosomiche cresce con l’aumentare dell’età materna.
La risposta è fornita solo in termini di probabilità sulla base dell’esame eseguito; questa probabilità è espressa con un valore numerico (es.
Avere uno screening positivo significa appartenere ad un gruppo di donne con un rischio più alto di avere un feto affetto da S.
Il risultato è considerato positivo se il rischio è di 1:350 o più grande. D’altra parte se il rischio è più piccolo (es. 1:1000) significa che la gestante appartiene ad una popolazione con rischio diminuito.
Anomalie Cromosomiche: Cosa Sono?
Le anomalie cromosomiche sono alterazioni del numero o della struttura dei cromosomi.
Le anomalie numeriche dei cromosomi, che vengono chiamate anche aneuploidie, sono caratterizzate da un numero maggiore o inferiore di cromosomi rispetto al numero standard.
Si parla, ad esempio, di trisomia, quando si riscontra la presenza di un cromosoma in più. A questo gruppo di anomalie cromosomiche appartengono patologie note come Sindrome di Down o Trisomia 21, dove l’individuo presenta 47 cromosomi, ovvero possiede una copia in più del cromosoma 21. La trisomia 13, invece, prende il nome di Sindrome di Patau, mentre la trisomia 18, Sindrome di Edwards.
Si parla, invece, di monosomia, quando si riscontra l’assenza di un cromosoma.
Per quanto riguarda i cromosomi sessuali, X ed Y, la situazione è diversa. Infatti in questi casi l’aberrazione non è una vera e propria trisomia bensì la perdita o l’aggiunta di uno dei due cromosomi rispetto all’assetto normale XX che caratterizza il sesso femminile od XY proprio di quello maschile.
Tra le aneuploidie, le trisomie 21, 18, 13 e le aneuplidie dei cromosomi sessuali (es. monosomia X), comprendono circa l’80%-95% delle possibili anomalie cromosomiche rivelabili tramite la determinazione del cariotipo.
Tali anomalie cromosomiche sono senz’altro quelle maggiormente responsabili di malformazioni fetali che portano a gran parte degli aborti precoci ossia durante il primo trimestre di gravidanza.
In alcuni casi le gravidanze con feti affetti da trisomia 21, 18 e 13 possono procedere nel corso dell’età gestazionale e portare alla nascita di neonati affetti dalla relativa patologia cromosomica (probabilità di sopravvivenza alla nascita rispettivamente del 22,1%, 5,4% e 2,8%).
Il meccanismo principale con cui si producono le aneuploidie è costituito dalla non-disgiunzione, ovvero dalla mancata separazione dei cromosomi omologhi o dei cromatidi durante la meiosi nel corso della gametogenesi.
È ormai noto che dell’incidenza di anomalie cromosomiche è direttamente proporzionale all’età materna. In particolare per la sindrome di Down si calcola che oltre i 40 anni una gravidanza su 100 sia interessata da questo tipo di anomalia.
Tale fenomeno ha avuto, in questi ultimi anni, un impatto non indifferente a livello etico - sociale in quanto l’età media al primo parto è aumentata in maniera considerevole. Si pensi infatti che nell’ultimo trentennio, si è passati dai 20-21 anni ai 29-30 attuali.
Tecniche di Diagnosi Prenatale: QF-PCR e Cariotipo Molecolare
QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR)
Nell’ambito della diagnosi prenatale, oltre ai test genetici già descritti, è sempre più utilizzata una tecnica di diagnostica molecolare che permette diagnosi rapida di alcune aneuploidie fetali (quelle relative ai cromosomi 21, 13, 18, X e Y), conosciuta come amplificazione enzimatica in vitro del DNA fluorescente o QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR).
Oggi tal tecnica, che si e’ ormai sostituita completamente alla tecnica di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH), affianca le analisi citogenetiche tradizionali eseguite di routine e dalle quali si differenzia per una maggiore rapidità (risultato disponibile entro entro 24h-48h dal prelievo), per la necessità di una minore quantità di liquido amniotico (1-1,5 ml), 1-2 villi coriali, 0,1 ml di sangue fetale, partendo da DNA estratto da materiale cellulare non coltivato.
Il fattore più importante, rispetto alle tecniche tradizionali, è legato alla possibilità di eseguire test di laboratorio precisi, affidabili e soprattutto rapidi partendo da una minima quantità di materiale, a volte anche da poche cellule.
La verifica in termini qualitativi e quantitativi della segregazione degli alleli parentali mediante QF-PCR e corsa elettroforetica fluorescente dei prodotti di amplificazione permette di poter evidenziare nel feto la presenta di eventuali trisomie.
Per quanto riguarda i cromosomi sessuali viene impiegata una sequenza relativa al gene dell’amelogenina. In questo caso un campione che presenta 1 picco nell’amelogenina ed 1 o 2 picchi nel DXS8377 indica un assetto cromosomico femminile normale (XX); mentre un campione con 2 picchi di differente dimensione a livello dell’amelogenina ed 1 picco nel DXS8377 un assetto cromosomico maschile normale (XY).
L’applicazione della tecnica QF-PCR in epoca prenatale per il riconoscimento di alcune anomalie cromosomiche di numero, ha alcune limitazioni. Nel caso di QF-PCR positiva per una trisomia, l’esame non permette di distinguere tra una vera trisomia fetale ed un mosaicismo confinato alla placenta (o ad altri tessuti extra fetale) privo di significato patologico per il feto.
Cariotipo Tradizionale e Molecolare
L’approccio tradizionale nella diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche comporta la messa in coltura di cellule fetali ricavate da prelievi di liquido amniotico e la determinazione del cariotipo tramite l’analisi al microscopio dei cromosomi in metafase.
Benchè tale analisi sia abbastanza accurata, le colture cellulari impongono lunghi tempi di attesa che si aggirano intorno ai 15-20 giorni.Il cariotipo tradizionale, inoltre, non garantisce che il feto sia esente da malattie genetiche o alterazioni cromosomiche (delezioni o duplicazioni) di piccole dimensioni. Infatti, questo tipo di esame fornisce informazioni solo sulle principali anomalie cromosomiche (ad esempio la trisomia 21, o Sindrome di Down, le trisomie 18 e 13, la monosomia X, o Sindrome di Turner) attraverso la determinazione dell’intero assetto cromosomico fetale.
Con il cariotipo tradizionale si indaga essenzialmente su quelle forme patologiche che interessano il numero e l’aspetto grossolano dei cromosomi.
Lo studio del cariotipo fetale, a differenza dell’amniocentesi rapida con la tecnica QF-PCR, presenta un’ importanza diagnostica elevatissima perché evidenzia le anomalie cromosomiche più severe e frequenti ( come ad esempio le trisomie ) a carico di tutti i cromosomi, tuttavia, a causa dei limiti di risoluzione della tecnica, piccoli riarrangiamenti cromosomici potrebbero non essere facilmente evidenziabili.
Cariotipo Molecolare (Array-CGH)
Rispetto all’esame citogenetico tradizionale, l’analisi molecolare dei cromosomi ha una risoluzione molto più elevata (ca. 100 volte).
Ciò consente di identificare alcune patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche (microdelezioni e le micro duplicazioni), non evidenziabili tramite il cariotipo tradizionale, aumentando sensibilmente l’accuratezza dell’esame.Il cariotipo molecolare, infatti, consente di effettuare rapidamente non solo lo studio dell’assetto cromosomico fetale, ma anche di un gruppo di 100 patologie causate da microdelezione / microduplicazione cromosomica (es.
L’ analisi array-CGH, rappresenta anche una tecnica ideale di approfondimento diagnostico di 2^ livello, eseguita per integrare l’analisi citogenetica prenatale al fine di definire più accuratamente eventuali anomalie cromosomiche precedentemente identificate o per rivelare microriarrangiamenti non evidenziabili con l’indagine del cariotipo fetale.
Test AURORA: Affidabilità e Interpretazione dei Risultati
I risultati del test AURORA vengono forniti in termini chiari e facilmente comprensibili. Nel referto sarà semplicemente indicato «assenza di aneuploidia cromosomica (basso rischio)» oppure «presenza di aneuploidia cromosomica (alto rischio)». Il servizio di AURORA mette a disposizione dei ginecologi anche la consulenza genetica per assistere al meglio i pazienti nell’interpretazione dei dati, specialmente nei casi di «presenza di aneuploidia cromosomica (alto rischio)».
- Risultato "Assenza di aneuploidia cromosomica (basso rischio)": Indica l’assenza di un’aneuploidia cromosomica. Il risultato del test ha una sensibilità del 99,9% per la trisomia 21, 18 e 13 e di poco inferiore per le altre aneuploidie indagate. L’affidabilità del risultato è riportata nella sezione “Accuratezza del test Aurora” del referto.
- Risultato "Presenza di aneuploidia cromosomica (alto rischio)": Tale risultato è suggestivo di una delle anomalie cromosomiche indagate ma non assicura che il feto abbia tale anomalia. In caso di rilevazione di una o più aneuploidie si consiglia di eseguire un test di diagnosi prenatale invasiva (es. amniocentesi) per la conferma del risultato.
- Risultato non conclusivo: In alcuni casi il test potrebbe produrre un risultato non conclusivo, ad esempio, se la quantità di DNA fetale è insufficiente per completare lo studio entro parametri prestazionali stabiliti. In questo caso, è necessario ripetere l'analisi su un nuovo campione.
Amniocentesi Genomica PrenatalWES
Tramite un prelievo di liquido amniotico, effettuato dalla 15° settimana di gravidanza, è possibile indagare lo stato di salute fetale ed ottenere informazioni a partire da una visione macroscopica del corredo cromosomico (come le più conosciute trisomie 21, 18, 13) per arrivare ad informazioni microscopiche della sequenza del DNA (come le malattie monogeniche).
Perché è un test innovativo?
L’amniocentesi genomica PrenatalWES viene eseguita anche su feto a basso rischio, in assenza di anomalie ecografiche o di storia clinica familiare della coppia. In passato queste indagini erano accessibili esclusivamente in presenza di un rischio clinico. Oggi, grazie all’evoluzione della tecnologia e alle conoscenze sull’interpretazione dell’esoma completo, è possibile eseguire l’analisi su feti “apparentemente” sani.
Non tutte le malattie conosciute si presentano attraverso anomalie ecografiche riscontrabili già in epoca prenatale. La maggior parte di queste passano inosservate, o si presentano de novo, manifestandosi solo dopo la nascita o nei primi anni di vita. L’unica strategia scientificamente riconosciuta per poterle identificare in epoca prenatale è il sequenziamento dell’esoma completo.
L’amniocentesi genomica PrenatalWES ha superato le precedenti metodologie di indagine come gli arrayCGH e l’utilizzo di singoli pannelli genici.
La possibilità di sequenziare l’esoma completo consente con la stessa metodologia di ottenere una quantità di informazioni genetiche molto più estese ed accurate, indagando le anomalie cromosomiche, come delezioni e duplicazioni di regioni cromosomiche, ed oltre 1200 geni associati a malattie genetiche note.
Molte delle malattie monogeniche sono condizioni che, se intercettate tempestivamente, possono essere gestite attraverso trattamenti preventivi ed impedire che la malattia si manifesti,come ad esempio per la leucodistrofia metacromatica, grave patologia neurodegenerativa, rara e progressiva.
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