L'immunofenotipo è un esame che serve ad identificare le sottopopolazioni di globuli bianchi o leucociti, rilevando la presenza o l’assenza di specifici antigeni o marcatori (proteine) presenti sulla membrana cellulare. L’immunofenotipo rileva la presenza o l’assenza di specifici antigeni espressi dai globuli bianchi o leucociti (WBC). Questi antigeni sono proteine presenti sulla superficie o all’interno dei WBC.
Nei leucociti normali sono presenti gruppi di antigeni caratteristici degli specifici tipi di cellule e dello stadio di maturazione cellulare. In presenza di leucemia o linfoma sono presenti dei quadri antigenici alterati ma caratteristici per ciascun tipo di patologia e sottoclasse. L’analisi di tali antigeni o marcatori, permette di riconoscere i globuli bianchi di origine cancerosa.
L’immunofenotipo viene utilizzato principalmente come supporto alla diagnosi, alla classificazione dei tumori del sangue (leucemie e linfomi) ed alla scelta dei trattamenti terapeutici. L’immunofenotipo può essere richiesto in seguito al riscontro di un numero aumentato di linfociti (o talvolta di altri tipi di leucociti), di anemia, di una diminuzione delle piastrine o della presenza di cellule immature nel sangue, rilevate tramite la conta differenziale o l’emocromo.
Come viene eseguito l'esame
Un campione di sangue venoso viene prelevato dal braccio; talvolta il clinico può anche prelevare un campione di midollo osseo o un campione di tessuto, ad esempio un linfonodo, tramite biopsia tissutale o agoaspirato. Nel caso in cui sia possibile rilevare le cellule anomale direttamente in circolo, viene utilizzato preferenzialmente il campione di sangue, per la sua facilità di prelievo e la scarsa invasività.
Preparazione del campione
A questo scopo, è possibile utilizzare siero (0.5-1 ml) dello stesso paziente, eventualmente diluito in fisiologica se necessario, oppure terreni per colture cellulari cme l'RPMI. Al contrario, è controindicato risospendere le cellule in soluzione fisiologica senza aggiunta di siero autologo, in quanto le cellule andrebbero incontro a rapida degenerazione.
Il sangue prelevato viene posto in una provetta etichettata. L'etichetta presente sulla provetta contiene tutte le informazioni necessarie per assicurare che il campione sia analizzato per gli esami richiesti e che i risultati siano abbinati al nome della persona.
Dal punto di vista del paziente, il test è identico ad un normale prelievo ematico. Dopo aver accuratamente disinfettato il braccio del paziente, infatti, il personale medico provvede ad inserire l’ago per il prelievo in una vena, estraendo alcune provette di sangue. Al pari di un comune esame del sangue, il prelievo può essere fastidioso o provocare disagio nei pazienti particolarmente sensibili all’uso di aghi.
Interpretazione dei risultati
L’interpretazione dell’immunofenotipo e quindi della presenza/assenza di particolari marcatori antigenici richiede personale esperto. Il professionista specializzato nell’identificazione e nello studio di tumori ematologici o malattie del sangue, fornisce un’interpretazione diagnostica dell’immunofenotipo contestualmente alle informazioni ottenute da emocromo, conta differenziale, striscio di sangue e analisi del midollo osseo.
Le cellule tumorali, se presenti, vengono identificate tramite i marcatori (antigeni) presenti nelle cellule e rilevati tramite l’immunofenotipo. Nelle cellule normali sono presenti gruppi di antigeni caratteristici degli specifici tipi di cellule e dello stadio di maturazione cellulare (le cellule del sangue normalmente maturano nel midollo osseo e, raggiunta la maturazione, vengono rilasciate nel sangue).
Nonostante la presenza di particolari antigeni sia associata a particolari forme di leucemia o linfoma, è importante considerare il fatto che la situazione di ciascun paziente potrebbe essere unica. Le cellule B mature sono normalmente positive per il CD20 ma non per il CD34. CD20 è un marcatore di maturità e CD34 un marcatore di immaturità.
La diagnosi di leucemia o linfoma si avvale di un esame effettuato su striscio di sangue o su biopsia o aspirato midollare per la ricerca di particolari tipi di cellule. In base alla presenza di particolari quadri antigenici e alla loro associazione con particolari tipi di tumore, il clinico può formulare una prognosi riguardante il grado di risposta al trattamento e di conseguenza decidere l’aggressività di un particolare trattamento.
Generalmente gli antigeni presenti in un particolare tipo di cancro rimangono invariati; tuttavia, i trattamenti chemioterapici possono eliminare alcuni tipi di cellule anomale.
Il ruolo dei marcatori CD
La maggior parte degli antigeni rilevati tramite l’immunofenotipo vengono denominati con la sigla CD (cluster of differentiation o cluster of designation) seguita da un numero.
L’analisi dei linfociti con i marcatori CD3, CD4 e CD8 viene utilizzata nel monitoraggio dei pazienti affetti da HIV/AIDS.
Applicazioni cliniche dell'immunofenotipo
L’esecuzione della citofluorimetria è indicata ogni volta che si è ha un sospetto clinico di neoplasia ematopoietica (es. L’immunofenotipo viene utilizzato principalmente come supporto alla diagnosi, alla classificazione dei tumori del sangue (leucemie e linfomi) ed alla scelta dei trattamenti terapeutici.
L’immunofenotipo può essere richiesto in seguito al riscontro di un numero aumentato di linfociti (o talvolta di altri tipi di leucociti), di anemia, di una diminuzione delle piastrine o della presenza di cellule immature nel sangue, rilevate tramite la conta differenziale o l’emocromo.
Sono disponibili opzioni terapeutiche recenti, come la terapia CAR-T, gli anticorpi bispecifici delle cellule T (bispecific T-cell engagers) e gli anticorpi monoclonali diretti contro molecole specifiche, come CD19 o CD20.
Un’altra tecnica per ottenere l’immunofenotipo delle cellule è l’immunoistochimica. Questo approccio consiste nell’incubare una sezione di tessuto posta su vetrino con degli anticorpi, specifici per un tipo di antigene tipicamente presente sulla superficie delle cellule anomale associate ad una particolare leucemia o linfoma.
Linfociti e tipizzazione linfocitaria
I linfociti sono cellule che, tipicamente, vanno a costituire all’incirca il 25% della quantità totale dei globuli bianchi (chiamati anche leucociti) presenti nell’organismo umano. Esistono due tipologie di linfociti: i linfociti B, che sono cellule del sistema immunitario umorale e riconoscono gli antigeni, producendo anticorpi per contrastarli; e i linfociti T, ossia cellule del sistema immunitario cellulo-mediato che secernono le citochine.
Tipi di linfociti
- linfociti B: cellule del sistema immunitario detto umorale. I linfociti B, prodotti nel midollo osseo, hanno la funzione di produrre anticorpi. La conta dei linfociti B è utile per valutare la loro maturità e per accertare (diagnosticare) la leucemia B cronica e la leucemia prolinfocitica. I linfociti B possono essere ulteriormente suddivisi in sottopopolazioni identificate con CD5, CD10, CD15, CD20, CD23, CD38.
- linfociti T: cellule del sistema immunitario detto cellulo-mediato. Secernono alcune molecole, le citochine, che regolano l’attività del sistema di difesa dell’organismo, attivandolo o inibendolo.
- linfociti T totali (CD3): hanno sulla superficie della membrana l’antigene CD3. Sono essenziali nell'immunità cellulo-mediata.
- linfociti T helper (CD4): sono chiamati linfociti CD3+/CD4+ perché sulla loro superficie cellulare, oltre all’antigene CD3, è presente l’antigene CD4 che conferisce loro la proprietà di stimolare o “aiutare” (helper) i linfociti B a produrre anticorpi.
- linfociti T citotossici (CD8): sono chiamati CD3+/CD8+ perché sulla loro superficie cellulare, oltre all’antigene CD3, è presente l’antigene CD8.
- linfociti NK (Natural Killer): sono detti CD3+/CD56+. Sono una sottopopolazione linfocitaria in grado di produrre citochine (per esempio l’interferone gamma) e di riconoscere e distruggere le cellule tumorali e le cellule infettate da virus.
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie si basa sull’identificazione degli antigeni (proteine) chiamati CD (cluster differentiation, gruppo di differenziazione) presenti sulla loro membrana cellulare.
La tipizzazione linfocitaria è un’analisi fondamentale per l’accertamento e la diagnosi delle malattie ematologiche, ossia che colpiscono il sangue, così come di diverse patologie che interessano il sistema immunitario.
La tipizzazione linfocitaria è un esame indispensabile per accertare (diagnosticare) le malattie del sangue (ematologiche) e del sistema di difesa dell’organismo (sistema immunitario).
Linfocitosi: quando preoccuparsi
Una linfocitosi cronica può indicare patologie ematologiche più complesse, come leucemie o linfomi. Alcuni tumori ematologici sono associati a un aumento anomalo dei linfociti nel sangue. Le forme più comuni sono la leucemia linfatica cronica (LLC) e la leucemia linfoblastica acuta (LLA), che colpiscono rispettivamente adulti e bambini.
La presenza persistente di linfociti alti, soprattutto se associata a sintomi sistemici, richiede una valutazione ematologica. Un’ulteriore indagine può escludere o confermare una neoplasia come causa.
Può essere utile anche la TAC total body per cercare linfonodi ingrossati o rilevare la presenza di masse.
Citofluorimetria: un vantaggio nella diagnosi
Il principale vantaggio della citofluorimetria è rappresentato sicuramente dalla tipologia di prelievo (ago aspirato/infissione), meno invasivo rispetto ad una biopsia chirurgica. Molto spesso la citologia è sufficiente infatti a dare un’indicazione di neoplasia ematopoietica/a cellule rotonde.
A questo scopo, infatti, è possibile ricorrere alla citofluorimetria al termine del protocollo chemioterapico, per valutare la malattia minima residua, cioè quantificare nelle diverse matrici (linfonodo, sangue, midollo, ecc.) la percentuale di cellule neoplastiche ancora presenti. Questo può essere fatto purché sia noto il fenotipo della neoplasia prima della terapia.
Esami correlati: emocromo e mielogramma
L’esame emocromocitometrico si è trasformato in un profilo ematologico completo, comprendente misurazioni quantitative dirette e indici da esse derivati, che informano sulle proprietà dei globuli rossi, delle piastrine e dei leucociti.
Quando i parametri del referto emocromocitometrico rientrano nei valori di normalità per età, sesso e razza (Dacie and Lewis, 2006), in assenza di una specifica richiesta clinica, l’esame viene validato senza eseguire ulteriori approfondimenti diagnostici.
In presenza di alterazioni di tipo quantitativo e/o qualitativo dell’esame emocromocitometrico e/o in presenza di allarmi strumentali, è necessario allestire uno striscio di sangue periferico, colorato con colorazioni panottiche ed esaminato al microscopio ottico.
L’esecuzione dell’agoaspirato midollare trova precise indicazioni in quasi tutte le neoplasie ematologiche e viene in genere eseguito sulla base di un esame emocromocitometrico alterato e/o francamente patologico.
Il Comitato Internazionale per la Standardizzazione in Ematologia (ICSH) ha pubblicato nel 2008 (Lee SH, 2008) un documento contenente le indicazioni per l’esecuzione (Tabella 3) e le modalità di refertazione di questo esame, in accordo con il documento WHO 2008.
Uno dei punti cruciali rimane l’aliquota di sangue midollare utlizzata per eseguire gli strisci: un preparato per essere rappresentativo della reale distribuzione cellulare midollare deve essere allestito con la prima aliquota prelevata dal midollo osseo, aliquota che deve essere compresa tra 0,2-0,5 ml. Al di sopra di questa quantità la contaminazione con sangue periferico impedisce la produzione di un mielogramma rappresentativo, come ben rappresentato nel lavoro di Dresch et al, 1974 (Dresch C, 1974) (Figura 24).
Il preparato di agoaspirato può essere allestito sia per apposizione con delicato schiacciamento dei frustoli midollari che per striscio dei frustoli midollari. Con la prima metodica si ottiene una buona valutazione della cellularità, dei megacarociti, delle cellule a bassa frequenza e/o della presenza di eventuali raggruppamenti cellulari focali: tuttavia con questo allestimento i dettagli delle cellule risultano meno evidenti.
I preparati allestiti, una volta essiccati, vengono colorati con colorazioni panottiche standard.
Tabella: Confronto tra linfociti B e T
| Caratteristica | Linfociti B | Linfociti T |
|---|---|---|
| Funzione principale | Produzione di anticorpi | Immunità cellulo-mediata |
| Sede di maturazione | Midollo osseo | Timo |
| Marcatori tipici | CD19, CD20 | CD3, CD4, CD8 |
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