Immunodiffusione: Scopri Tutto Sugli Esami Del Sangue Essenziali!

L'immunodiffusione è una tecnica che coinvolge la diffusione di antigene o anticorpo attraverso un mezzo semisolido, usualmente agar o agarose gel, con il risultato di una reazione di precipitazione. Riteniamo che lei si riferisca alla tecnica di “immuno diffusione radiale”. Per immunodiffusione si intende qualunque tecnica che coinvolge la diffusione di antigene o anticorpo attraverso un mezzo semisolido, usualmente agar or agarose gel, con il risultato di una reazione di precipitazione.

La immunodiffusione radiale è una tecnica di immunodiffusione quantitativa in cui le soluzioni di antigene sono poste in pozzetti in una piastra di agar che contiene antisiero; in tal modo si determina la quantità di antigene presente. L'immunodiffusione radiale semplice consiste nello scavare dei pozzetti in un terreno di agar in cui sia stato disciolto un anticorpo specifico, nel porre in questi pozzetti degli antigeni e nell'osservare gli anelli di precipitazione formatisi.

Man mano che l'antigene diffonde nell'agar si forma un precipitato ad anello che si muove verso la periferia, divenendo stazionario nella zona di equivalenza. Il diametro dell'anello è funzione della concentrazione di antigene. Ponendo in un grafico il diametro dell'anello (l'area del cerchio) al punto di equivalenza contro la concentrazione di antigene, si ottiene una retta di taratura che consente di determinare la concentrazione di antigene in un campione ignoto.

Tecniche di Immunodiffusione

Questa tecnica permette di stabilire se gli antigeni depositati nei diversi pozzetti sono o non sono identici o se hanno epitopi in comune. Si ha una reazione di identità tra più antigeni contenenti identici epitopi quando le bande di precipitazione si fondono lungo una linea continua. Si ha invece una reazione di non identità quando il pozzetto centrale contiene anticorpi contro entrambi gli antigeni, ma questi non hanno un epitopo in comune: si ottengono in questo caso due bande di precipitazione che si intersecano.

Si ha infine una reazione di identità parziale quando i due antigeni hanno almeno un epitopo in comune, ma gli anticorpi utilizzati riconoscono sia l’epitopo in comune sia un altro epitopo proprio di uno solo degli antigeni. La posizione relativa della banda di precipitazione fornisce anche una stima semiquantitativa della concentrazione di antigene: infatti la distanza della banda di precipitazione dal pozzetto contenente l’antigene è proporzionale alla quantità di antigene presente: tanto maggiore è la quantità di antigene tanto maggiore è la distanza della banda.

Tecnica di precipitazione in cui un antigene e un anticorpo diffondono in un mezzo costituito da un gel, producendo linee di precipitine nei siti in cui le concentrazioni dell’antigene e dell’anticorpo sono ottimali per la precipitazione di complessi insolubili. Il principio di base viene impiegato, da solo o in combinazione con i principi elettroforetici, in numerose metodiche qualitative, semiquantitative e quantitative, come la diffusione radiale e l’immunoelettroforesi. La tecnica è nota anche come test di diffusione.

Immunodiffusione Radiale: Misurazione Quantitativa degli Antigeni

Immunodiffusione radiale Metodica per la misurazione quantitativa di un antigene in una soluzione. Una quantità dell’antigene da misurare viene posta in un pozzetto in una piastra con agar contenente un anticorpo distribuito uniformemente. Quando l’antigene diffonde all’esterno del pozzetto, si forma un anello di precipitine, in cui le concentrazioni dell’antigene e quelle dell’anticorpo sono ottimali. Il raggio dell’anello è proporzionale alla concentrazione dell’antigene.

Le concentrazioni assolute possono essere ricavate per confronto con le dimensioni di anelli ottenuti con l’impiego di preparati standard in concentrazioni note.

Elettroforesi e Immunofissazione

L'elettroforesi è un'analisi di laboratorio che permette di determinare la quantità di proteine presenti nel siero sanguigno o in altri campioni biologici e, per ogni frazione, rivela se siano presenti delle anomalie in termini di qualità. L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche, attraverso una soluzione ed un mezzo di supporto inerte, sotto l'influenza di un campo elettrico, generato da una corrente continua.

In pratica, l'esame sfrutta la carica elettrica e la massa molecolare delle proteine presenti nel campione del paziente. Sotto l'impulso di un campo elettrico, queste macromolecole migrano e si "raggruppano" per tipologia, rispondendo alla sollecitazione in un modo caratteristico. Il risultato (tracciato elettroforetico) è costituito da vari picchi e curve, a cui corrispondono le frazioni delle proteine.

Normalmente, il primo picco, più alto e stretto, è quello dell'albumina; a seguire, si osservano i picchi delle globuline, molto più bassi rispetto all'albumina. L'aumento o la diminuzione in ampiezza ed intensità dei picchi che si formano nel tracciato indicano una maggiore o minore presenza delle proteine di ogni categoria; più proteine sono presenti in una banda, più alto è il rispettivo picco.

Nel caso delle gamma globuline, se si vuole conoscere la quantità di ognuna delle diverse classi (IgA, IgM, IgG ecc.) sarà necessario ricorrere al dosaggio singolo. Nel dettaglio, l'analisi permette di studiare - nel sangue o nelle urine del paziente - le classi di immunoglobuline (IgA, IgG, IgM, IgE o IgD) ed il tipo di catena leggera kappa o lambda, in funzione della loro specifica mobilità elettroforetica.

Il Processo di Immunofissazione

Successivamente, per l'identificazione di quale globulina gamma sia chiamata in causa, l'immunofissazione prevede l'inoculo di antigeni specifici per il frammento o l'anticorpo corrispondente (antisieri anti-immunoglobulina): la presenza dell'alterazione sospettata è confermata dalla formazione di un precipitato, visibile ad occhio nudo o al microscopio. Queste informazioni sono di grande importanza per stabilire, in particolare, la diagnosi delle patologie delle plasmacellule (gammopatie o discrasie plasmacellulari).

Esecuzione dell'Immunofissazione:

Elettroforesi in Gel d'Agarosio: il campione del paziente (siero o urina) viene depositato su una striscia elettroforetica, cioè il supporto per la migrazione (di solito, gel di agarosio). Attraverso l'applicazione di un campo elettrico, generato da una corrente continua, si ottiene la separazione in diverse bande. In pratica, ogni tipologia di gamma globulina presente in miscela (cioè nel campione del paziente) migra in base alla massa molecolare ed alla carica elettrica.
Immunoprecipitazione con Antisieri Specifici (Fissazione): sono aggiunti singolarmente, a ciascuna striscia elettroforetica, gli antigeni specifici per un determinato anticorpo o un frammento (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-catena leggera kappa o anti-catena leggera lambda). Se è presente una proteina monoclonale, l'interazione dell'antigene con l'anticorpo corrispondente produrrà una banda stretta (ciò significa che il risultato è positivo) e la formazione di un precipitato, visibile ad occhio nudo o al microscopio.

Nota bene: l'intervallo di riferimento dell'esame può variare leggermente in funzione di età, sesso e strumentazione in uso nel laboratorio analisi. Per questo motivo, è preferibile consultare i range riportati direttamente sul referto.

Preparazione e Prelievo

L'immunofissazione sierica prevede un semplice prelievo di sangue dalla vena di un braccio. Il siero è ottenuto per centrifugazione del campione biologico; ciò consente, infatti di separare la frazione contenente le cellule (parte corpuscolare) da quella liquida del sangue (plasma). Per l'esecuzione dell'immunofissazione urinaria è necessario raccogliere una piccola quantità di urine in un apposito contenitore sterile.

Prima del prelievo ematico, alcuni laboratori potrebbero richiedere di osservare un digiuno di almeno 10-12 ore. Nei sei mesi precedenti l'esame, la somministrazione di vaccini (immunizzazione) e l'uso di farmaci, quali fenitoina, procainamide, contraccettivi orali, metadone e gammaglobuline terapeutiche, possono aumentare la concentrazione delle immunoglobuline.

Interpretazione dei Risultati

Il risultato dell'immunofissazione è valutato in combinazione all'esito di altre analisi. L'interpretazione del reperto spetta al medico di base o allo specialista di riferimento che può identificare e rapportare le alterazioni a carico di una specifica gamma globulina (ad esempio, la banda che coincide con le immunoglobuline G) a determinate malattie.

In alcuni casi, tutte le bande dell'immunofissazione risultano omogeneamente oscurate nella stessa misura. Questo modello rappresenta la presenza di immunoglobuline policlonali. Anche in questo caso, le banda sono ampie e la transizione ai bordi della striscia immunoelettroforetica è graduale.

Inoltre, l'immunofissazione può essere utilizzata per monitorare la terapia nelle discrasie plasmacellulari (cioè mieloma multiplo e macroglobulinemia di Waldenstrom). Se il livello di proteina monoclonale diminuisce o non è rilevabile dopo la chemioterapia, potrebbe indicare una risposta al trattamento.

Nota bene. Un risultato negativo all'immunofissazione non esclude sempre una discrasia delle plasmacellule. Ad esempio, un mieloma multiplo non secretivo o oligosecretorio può dare esito negativo sia nelle urine, che nel siero.

La riduzione delle gamma globuline può indicare la presenza di varie malattie del sistema immunitario su base genetica, tra cui l'agammaglobulinemia, o un'immunodeficienza secondaria (es.

Immunofissazione del Liquido Cerebrospinale

L'immunofissazione del liquido cerebrospinale (liquor) viene prescritta quando il medico sospetta la presenza della sclerosi multipla. In tal caso, il tracciato che viene a determinarsi è caratteristico, poiché evidenzia la presenza delle cosiddette bande oligoclonali. Il risultato è riportato nel reperto di laboratorio come positivo.

In altre parole, l'identificazione delle bande oligoclonali con l'immunofissazione del liquor è molto utile per supportare la diagnosi di sclerosi multipla, ma deve essere confermata da altre indagini.