Esame Istologico e Immunoistochimica: Guida Completa per Interpretazioni Accurate e Applicazioni Cliniche

Con il passare degli anni, la sezione di anatomia patologica si è progressivamente ingrandita, includendo nuove professionalità per approfondire i diversi settori. Le colorazioni istochimiche speciali e l’esame immunoistochimico sono tecniche diagnostiche ancillari all’esame istopatologico. Queste tecniche possono essere richieste o suggerite per confermare la diagnosi o fornire informazioni aggiuntive rispetto a quanto osservabile con la sola valutazione istopatologica (con colorazione di routine Ematossilina ed Eosina).

Nella maggior parte dei casi, si tratta di esami eseguibili sul campione già inviato in formalina, e solo una piccola percentuale di colorazioni va eseguita su campione di tessuto non fissato in formalina e congelato.

Raccolta e Preparazione dei Campioni

La corretta preparazione del campione è fondamentale per l'accuratezza dell'esame. Ecco alcune linee guida:

Contenitori: Il barattolo deve essere contrassegnato in modo univoco, avere ampia imboccatura e va accuratamente chiuso per evitare perdite di liquido (la formalina è una sostanza cancerogena ed altamente tossica). Il laboratorio offre la possibilità di usufruire di barattoli da biopsia di varia misura.
Campioni multipli: Si suggerisce di inviare i campioni in barattoli separati, per facilitare la loro identificazione.
Campioni di grandi dimensioni: Ci sono due opzioni:
1. Il campione può essere pre-fissato dal veterinario, eventualmente in seguito ad incisioni per facilitare il processo di fissazione, avvolto in garze immerse in formalina ed inserito in uno o più contenitori idonei.
2. Se le lesioni sono chiaramente identificabili, è possibile inviare solo porzioni della massa, assicurandosi di includere diverse aree, comprese quelle di interfaccia con il tessuto normale.
Campioni di piccole dimensioni: Si suggerisce di utilizzare contenitori di piccole dimensioni e, possibilmente, biocassette.
Valutazione dei margini: È indispensabile richiedere l’esame dei margini prima che il campione venga manipolato in laboratorio.
Tempi di refertazione: 7 giorni lavorativi dal ricevimento del campione.
Conservazione: Campione in formalina o blocchetti di paraffina; non refrigerato.

Colorazioni Istochimiche Speciali

La colorazione istochimica semplicemente permetterà di “vedere meglio” l’agente eziologico se presente. Talvolta la morfologia dell’agente sarà sufficiente a classificarlo precisamente, ma talvolta si potrà solo confermare la presenza di un agente e classificarlo come batterico, fungino, ecc.

Esame Immunoistochimico: Principi e Metodologie

L’esame immunoistochimico, come indica il nome stesso, prevede l’utilizzo di anticorpi attraverso i quali sarà possibile individuare specifiche molecole nella sezione di tessuto. L’esame immunoistochimico può essere eseguito per via diretta o indiretta, anche se attualmente la maggior parte dei kit e coloratori automatici, utilizzano una metodologia indiretta. La metodica indiretta si avvale di un anticorpo definito “primario” che legherà un determinato antigene che si vuole identificare nella sezione di tessuto.

Nel nostro laboratorio, la colorazione immunoistochimica è eseguita mediante l’utilizzo del coloratore automatico Leica Bond RX, al fine di ottenere la migliore standardizzazione e ripetibilità dei risultati. Il nostro laboratorio dispone di un vasto parco anticorpi, in continua evoluzione ed aggiornamento, sulla base dei lavori scientifici di riferimento più recenti. L’esame viene effettuato su sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico.

L'ibridazione in situ consente di evidenziare la produzione di mRNA all’interno delle cellule, consentendo di valutarne sia la presenza che la localizzazione.

Applicazioni dell'Immunoistochimica

Nella diagnostica di routine l’esame immunoistochimico viene principalmente utilizzato per una migliore caratterizzazione delle neoplasie la cui istogenesi non può essere totalmente definita con la sola valutazione istopatologica. Per tale scopo vengono utilizzati anticorpi che legano componenti cellulari intracitoplasmatici (es. citocheratine, vimentina), della membrana cellulare (es. CD3, CD20) o nucleari (es. MUM1) che sono specifiche e presenti in una o più popolazioni cellulari.

Al contrario, in neoplasie anaplastiche o scarsamente differenziate, l’esame immunoistochimico può essere non definitivo, in quanto il processo di “sdifferenziazione” può implicare la “perdita” dell’espressione delle molecole fenotipiche specifiche che le caratterizzano, e pertanto risultare non definitivamente classificabili.

Per la ricerca di agenti eziologici è necessario sottolineare alcune differenze rispetto alle colorazioni istochimiche speciali discusse precedentemente. Come già detto, nell’esame immunoistochimico si testano anticorpi specifici e se l’esito è positivo si potrà confermare la presenza di un agente specifico che si è ricercato. L’esame immunoistochimica per malattie infettive in medicina veterinaria trova un particolare utilizzo per malattie virali (es.

Va infine sottolineato che alcune solo alcune colorazioni immuno-istochimiche possono essere anche applicate ai campioni citologici (es. Immuno-citochimica per CD3 e CD20, per la tipizzazione di un linfoma), ma è importante rivolgersi al laboratorio per avere informazioni sulla fattibilità dell’esame. Nota bene: esistono casi di linfoma negativi per entrambi gli anticorpi. Talvolta l’esame immunoistochimico non è sufficiente a definire la diagnosi di linfoma e potrebbe essere suggerito l’esame di clonalità linfoide.

Esempi di Applicazioni Specifiche

Mastocitoma

Le colorazioni istochimiche Blu di Toluidina e GIEMSA spesso evidenziano i granuli dei mastociti (normali e neoplastici), che vengono definiti metacromatici. Queste colorazioni possono essere suggerite per confermare il sospetto di mastocitoma e migliorare la sensibilità nel ricercare e quantificare mastociti in un linfonodo. Quest’ultima evenienza permette di classificare l’eventuale coinvolgimento linfonodale secondo la classificazione di Weishaar (J. Comp.Path. 2014, Vol.

Integrazione del referto base, un’indagine immunoistochimica per C-Kit (CD117). Tale molecola è un recettore tirosin-chinasico che gioca un importante ruolo nelle neoplasie mastocitarie canine (così come in quelle umane). L’espressione immunoistochimica di questo marker è in condizioni normali è di tipo membranario, mentre viene considerata aberrante una sua localizzazione in sede citoplasmatica (a spot perinucleari o diffusa).

Melanoma

Sono molteplici invece i marker immunoistochimici che nel tempo si sono utilizzati per indicare l’origine melanocitica di neoplasie non pigmentate. Attualmente i più utilizzati sono PNL2 e Melan A. Nel nostro laboratorio, il Melan A è incluso nell’anticorpo “Melanoma Triple Cocktail” che include anche altri due anticorpi meno noti. CSPG4 viene proposto perché la sua valutazione è utile in caso di terapia elettrovaccinale sperimentale (Piras et al. Vet Comp Oncol.

Neoplasie Epiteliali

Le molecole che si utilizzano per l’identificazione immunoistochimica dell’istogenesi epiteliale sono le citocheratine. Esistono numerose citocheratine (filamenti intracellulari), alcune presenti in molte cellule di origine epiteliale (citocheratine AE1/AE3 o pancitocheratina), mentre altre sono specifiche per una o poche linee epiteliali (es.

Sarcomi Sottocutanei

I sarcomi sottocutanei sono, tra i tumori di origine mesenchimale, quelli che più frequentemente presentano pleomorfismo nonché caratteristiche morfologiche in parte sovrapponibili e che quindi devono essere differenziate mediante caratterizzazione fenotipica. Tra queste si pongono spesso problemi differenziali, nel cane, tra i tumori della parete vascolare e delle guaine dei nervi periferici. I primi appaiono spesso esprimere proteine contrattili tipici della muscolatura liscia, come Actina muscolare liscia e Desmina, mentre i secondi reagiscono assai di frequente ad S 100 e, più raramente, ma più specificamente, con GFAP.

Neoplasie Muscolari

Sebbene raramente, nel corso del flusso diagnostico istologico, i sarcomi originanti in sede muscolare striata scheletrica possono presentare alcuni aspetti morfologici tali da rendere dubbia la diagnosi. Questo è il caso, ad esempio, delle neoplasie vascolari che presentano aspetto epitelioide che sono poste in diagnosi differenziale con il rabdomiosarcoma. Le neoplasie di origine muscolare spesso presentano morfologia simile, soprattutto quando queste sono maggiormente indifferenziate. In questi casi è utile differenziare l’origine delle cellule neoplastiche tra muscolari lisce e muscolari striate. Le cellule muscolari hanno un fenotipo simile tra loro, sia per quanto riguarda la muscolatura liscia che striata, tuttavia, alcune proteine sono espresse solo nel muscolo striato, ed altre, come la actina (proteina contrattile coinvolta nell’attività della cellula muscolare), presentano differenti isoforme nelle due diverse cellule muscolari.

Tumori Gastrointestinali Stromali (GIST)

In molti casi, le neoplasie di origine muscolari liscia (leiomiosarcoma), che originano a livello dell’apparato gastrointestinale, nel cane, presentano morfologia smile ad un’altra neoplasia, che si sviluppa nell’ambito della parete enterica: il tumore gastrointestinale stromale. Questa neoplasia a cellule fusate, origina da elementi cellulari sparsi nello stroma della sottomucosa: le cellule di Cajal. Queste cellule hanno un particolare fenotipo, che comprende l’espressione di S100 e, soprattutto, CD117.

Fattori che Influenzano l'Esito dell'Esame Immunoistochimico

È importante segnalare come alcuni fattori possano incidere sull’ottimale riuscita dell’esame immunoistochimico e quindi rendere l’esame non praticabile o definitivo:

Alcuni trattamenti (es. corticosteroidi nel linfoma), possono alterare le caratteristiche fenotipiche delle cellule che possono risultare negative.
Un’inadeguata (scarsa o eccessiva) fissazione del campione, con presenza di autolisi e necrosi, possono inficiare l’ottimale riuscita dell’esame.

Tabella Riassuntiva dei Marker Immunoistochimici Comuni

Marcatore	Applicazione	Tessuto/Neoplasia
Citocheratine (AE1/AE3)	Identificazione origine epiteliale	Neoplasie epiteliali
Vimentina	Identificazione origine mesenchimale	Sarcomi
CD3	Identificazione linfociti T	Linfomi T
CD20	Identificazione linfociti B	Linfomi B
Melan A	Identificazione melanociti	Melanomi
CD117 (C-Kit)	Diagnosi e prognosi	Mastocitomi
Ki67	Valutazione frazione di crescita cellulare	Varie neoplasie

Viene selezionato un anticorpo (o più frequentemente un pannello di anticorpi ), detto anticorpo primario che, posto sulla sezione istologica ad un’opportuna diluizione, si lega agli antigeni tissutali da visualizzare. Il nostro laboratorio dispone di un vasto parco anticorpi, in continua evoluzione ed integrazione, in questa pagina sono riportati i pannelli maggiormente utilizzati, sarà quindi nostra cura provvedere ad aggiornare la pagina con le novità più recenti. La colorazione immunoistochimica è comunque una tecnica dinamica e pertanto può essere considerata su misura per il campione. In questo senso ci possono essere delle piccole differenze, caso per caso, segnalate e suggerite in sede di commento al referto istologico di pertinenza. Un esame IHC positivo eseguito in una lesione che si presenta suggestiva di FIP rappresenta il gold standard.

Nel caso del carcinoma, dove l’origine epiteliale della neoplasia è evidente già su base morfologica, può essere importante, soprattutto a fini stadiativi, caratterizzare ulteriormente l’epitelio di origine della linea cellulare coinvolta (es.

Negli ultimi anni questa neoplasia, specialmente nella specie canina, è stata oggetto di numerose indagini, tanto che nel 2011 è stata proposta una nuova classificazione (Kiupel et al.). Immunoistochimicamente, in base a tali studi, le indagini che si possono effettuare per scopi prognostici riguardano il pattern di espressione di CD 117 (kit) e l’espressione di Ki67 in rapporto all’indice di organizzatori nucleolari stabilito mediante colorazione argentica AgNOR.

Senza scendere ulteriormente nei dettagli esistono anche innumerevoli altri esempi di utilità diagnostica delle indagini di immunoistochimica. Come già accennato è compito del patologo, a seconda di ciascun caso istologico, indicare al clinico se vi siano e quali siano le ulteriori opportunità di approfondimento diagnostico utili ai fini prognostici/terapeutici. Resta poi una libera scelta del medico veterinario, dietro consiglio del suo oncologo clinico di fiducia, avvalersi o meno di tali indagini supplementari, anche a seconda della volontà e della compliance dei proprietari degli animali relativa all’iter oncologico/terapeutico del caso.

Un ulteriore, ma non meno importante, campo di utilità diagnostica dell’immunoistochimica si ha, infine, nella diagnostica infettivistica. In alcuni casi, infatti, la molecola target può essere un antigene espresso da un agente patogeno, come ad esempio un Papillomavirus o il Feline Infectious Peritonitis Coronavirus (il virus della FIP). In tal caso mediante l’immunoistochimica è resa possibile la visualizzazione diretta sui tessuti, nonché la relativa esatta localizzazione negli stessi, di uno specifico antigene, indicativo della presenza del patogeno stesso.