L'emoglobina (Hb) è una proteina tetramerica presente nel sangue dei vertebrati e degli invertebrati, essenziale per il trasporto dell'ossigeno. Costituita da quattro catene polipeptidiche, ogni catena contiene un gruppo eme capace di legare una molecola di ossigeno in modo non covalente. La capacità dell'emoglobina di legare l'ossigeno in modo cooperativo è fondamentale per la sua funzione fisiologica.
Cooperatività e sensibilità nel legame dell'ossigeno
La cooperatività si riferisce alla sensibilità con cui le proteine oligomeriche rispondono all'azione di leganti specifici. Nel caso dell'emoglobina, ogni unità funzionale (tetramero) si combina con più molecole di legante, e il numero massimo è pari ai monomeri che la costituiscono. Questa proprietà nasce dall'interazione che si stabilisce tra i vari siti di legame presenti sulla macromolecola oligomerica.
Si prenda in considerazione un’ipotetica emoglobina tetramerica (Hb) che leghi simultaneamente quattro molecole di un legante L (per es., l’ossigeno molecolare, O2), senza che si formino stati intermedi di associazione con L, e cioè siano presenti solo: Hb (con nessuna molecola di L legata, vale a dire con ν=0) e Hb(L)4 (con 4 molecole di L associate al tetramero, ovvero ν=4). Questo modello, che vuole rappresentare la massima cooperatività possibile per un tetramero di Hb, avrebbe un coefficiente di Hill uguale a 4.
Tuttavia, l’interazione simultanea di 4 molecole di L con un tetramero di Hb in pratica non avviene, tant’è che esistono sempre stati intermedi tra ν=0 e ν=4 (e cioè, ν=1, ν=2, ν=3), sebbene tali specie chimiche siano spesso presenti in quantità molto piccole.
L’esistenza della cooperatività può essere accertata paragonando la forma della curva che, per es., descrive l’associazione di O2, misurata all’equilibrio, all’Hb tetramerica, con quella di una emoproteina monomerica (cioè, con un solo sito di legame per l’O2), quale è la mioglobina, Mb, la proteina che all’interno dei muscoli immagazzina O2 e contribuisce al trasporto di questo gas fino ai mitocondri.
In ambedue i casi, la quantità di O2 legato reversibilmente, è determinata dalla sua pressione parziale, pO2, nell’atmosfera che insiste sulla soluzione di ciascuna emoproteina.
Il diagramma di Hill
Il diagramma di Hill è una rappresentazione grafica del legame dell'ossigeno all'emoglobina, in cui il logaritmo del rapporto tra la concentrazione degli emi occupati dall’O2 e di quelli liberi è funzione del logaritmo della pO2. Questa rappresentazione fornisce una misura della cooperatività.
Nel diagramma di Hill, a mano a mano che la pO2 viene aumentata a partire dal valore 0, la curva comincia a salire in modo rettilineo con una pendenza di 45° rispetto agli assi cartesiani (come avviene per qualsiasi sistema monomerico, quale è anche la Mb). Questa osservazione trova la sua spiegazione nel fatto che quando le molecole di O2 nell’ambiente sono scarse, solo un eme per ciascuna molecola tetramerica di Hb ha un’elevata probabilità di essere associato con una molecola di legante, e dunque tutti gli emi che vengono occupati dall’O2 in queste condizioni reagiscono in modo indipendente uno dall’altro, come se fossero quelli della Mb.
Incrementando il valore della pO2, il numero di emi per unità tetramerica che viene saturato con l’O2 aumenta (passando da 1 a 2 o a 3): in queste condizioni, si stabiliscono le interazioni tra gli emi che danno luogo al fenomeno della cooperatività, interazioni che avvengono per propagazione attraverso la matrice proteica e che producono il potenziamento dell’affinità per l’O2 degli emi ancora liberi dal legante e allo stesso tempo rendono la curva di ossigenazione sempre più ripida.
La curva termina con un’altra retta a 45° rispetto agli assi cartesiani, perché l’O2 è diventato così abbondante che un solo eme per ciascun tetramero di Hb ha la probabilità di essere ancora libero dal legante, e perciò tutti gli emi rimasti in soluzione reagiscono una volta ancora in modo indipendente l’uno dall’altro, come se si trattasse di molecole di Mb (infatti, le sole specie significative sono Hb(O2)3 e Hb(O2)4, e anche in questo caso la combinazione del tetramero con l’O2 interessa un solo sito di legame per ciascun tetramero).
Il coefficiente di Hill
Il coefficiente di Hill (n o nΗ) è il valore della pendenza della curva nel diagramma di Hill. Tale valore non rimane costante nell’intero intervallo di concentrazione del legante. Nelle condizioni estreme, la curva sale a 45° rispetto agli assi cartesiani, indicando una pendenza uguale all'unità (nΗ=1), e dunque una condizione di totale assenza di cooperatività.
Nella parte intermedia, il valore di nΗ cresce raggiungendo un valore massimo quando la saturazione degli emi con l’O2 è vicina alla metà dei siti di legame per unità strutturale. Tale valore di nΗ è, nella gran parte dei casi, costante tra il 25% e il 75% di saturazione, e pertanto non si commette un errore grossolano prendendo il coefficiente di Hill alla metà della saturazione con il legante (indicato spesso con n½) come una caratteristica del sistema.
In un vasto numero di studi su emoglobine normali tetrameriche (umane e di altre specie animali), il valore di n½ è compreso tra 2,5 e 3,3 in condizioni vicine a quelle fisiologiche, dimostrando l’esistenza di un alto grado di cooperatività tra gli emi.
Alcune varianti dell’emoglobina umana hanno valori di n½ molto più bassi; come caso estremo, si ricorda l’emoglobina Bart, composta da quattro catene β, che ha nΗ=1: è anche questa una molecola tetramerica, per la quale tuttavia l’accoppiamento funzionale che dà luogo alla cooperatività tra le singole subunità non esiste più, ciascuna catena β comportandosi in modo del tutto indipendente dalle altre tre presenti nel tetramero (come se si trattasse dunque di 4 molecole di mioglobina).
Il coefficiente di Hill dipende dalla concentrazione nell’ambiente di numerose specie chimiche (effettori allosterici di tipo eterotropico): ioni idrogeno, anidride carbonica, ioni cloruro e specialmente, un intermedio della glicolisi, il 1,2-bisfosfoglicerato. Quando si alza il livello di ognuno di questi fattori, la curva di ossigenazione diventa man mano più sigmoide (cioè, aumenta il valore numerico del coefficiente di Hill).
Equazione di Hill per gli enzimi allosterici
L’equazione proposta da Hill per il legame dell’O2 all’Hb è stata applicata alla descrizione cinetica di particolari enzimi, detti allosterici, cioè di quegli enzimi per i quali il grafico della velocità iniziale in funzione della concentrazione del substrato mostra una forma sigmoide del tutto differente dall’iperbole rettangolare che scaturisce dall’equazione di Michaelis-Menten.
In tali casi, è opportuno esprimere il grado di cooperatività di un enzima con la seguente equazione:
v/(V-v)=[S]ν/K½
ovvero, in termini logaritmici:
log{v/(V-v)}=nlog[S]ν −logK½
dove v è la velocità iniziale della reazione, V corrisponde alla velocità massima, [S] sta per la concentrazione del substrato, K½ è definita in modo simile alla costante di Michaelis-Menten (Kμ), e cioè come il valore della concentrazione del substrato a cui v=0,5V, e n è il coefficiente di Hill.
Conclusioni
Il coefficiente di Hill è uno strumento essenziale per quantificare la cooperatività nel legame dell'ossigeno all'emoglobina, fornendo una comprensione approfondita delle interazioni molecolari che influenzano l'affinità per l'ossigeno. La sua applicazione si estende anche agli enzimi allosterici, offrendo un quadro completo della regolazione biologica.
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