Elettroforesi su Gel: Guida Completa al Procedimento e Applicazioni Incredibili

Hai mai sentito parlare di elettroforesi proteica? Spesso citato nei risultati di analisi del sangue, questo esame è un potente strumento diagnostico per valutare lo stato di salute generale e identificare eventuali alterazioni delle proteine sieriche. In questo articolo, esploreremo i dettagli di questo esame, cosa significano i risultati e come può aiutarti a monitorare la tua salute. Scopriamo insieme tutto ciò che c’è da sapere su questa analisi.

Elettroforesi Proteica: cos’è e come funziona

Che cos’è l’Elettroforesi Proteica?

L’elettroforesi proteica è un’analisi di laboratorio che esamina le proteine contenute nel siero ematico. Queste proteine, chiamate sieroproteine, sono suddivise in frazioni principali: albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gamma globuline. Durante l’esame, le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica e dimensione utilizzando una tecnica elettroforetica, che produce un tracciato grafico che permette di individuare eventuali anomalie.

Le proteine sieriche svolgono ruoli essenziali nel corpo, come il trasporto di nutrienti, il supporto del sistema immunitario e la regolazione dei fluidi. Alterazioni nel tracciato elettroforetico possono essere segni di condizioni come infezioni, infiammazioni croniche, malattie del fegato o dei reni, o patologie più gravi come mieloma multiplo. Secondo studi recenti, circa il 10% dei pazienti con mieloma multiplo presenta un tracciato elettroforetico alterato già nelle fasi iniziali della malattia.

A cosa serve l’esame di Elettroforesi Proteica?

L’analisi di elettroforesi proteica è utile per rilevare cambiamenti nei livelli e nella distribuzione delle sieroproteine. È particolarmente utile per diagnosticare e monitorare condizioni come infiammazioni, infezioni croniche, malattie autoimmuni e tumori. Può anche aiutare a valutare la funzionalità epatica e la funzionalità renale, evidenziando alterazioni che potrebbero non essere visibili con altre analisi.

L’esame è spesso richiesto come parte di un controllo di routine, soprattutto quando si sospettano problemi legati alle proteine sieriche o alterazioni nei livelli di albumina. Grazie al tracciato elettroforetico, i medici possono ottenere un quadro chiaro della salute del paziente.

Come si effettua l’esame?

L’esame di elettroforesi proteica è molto semplice e non invasivo. Si preleva un campione di sangue, che viene poi analizzato in laboratorio. Le proteine sieriche vengono separate utilizzando un gel o una tecnica capillare, e il risultato è un tracciato grafico che mostra le diverse frazioni proteiche. Questo grafico è essenziale per l’interpretazione dei risultati e per identificare eventuali proteine alterate o livelli fuori norma.

Interpretazione del tracciato elettroforetico

Elettroforesi delle proteine: cosa si vede nel grafico

Il risultato dell’elettroforesi proteica si presenta sotto forma di un grafico che illustra le diverse frazioni proteiche. La frazione principale è l’albumina, seguita da alfa-1, alfa-2, beta e gamma globuline. Ogni frazione ha un ruolo specifico e un intervallo di valori normali.

Ad esempio, l’albumina rappresenta circa il 60% delle proteine sieriche totali e svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della pressione osmotica e nel trasporto di sostanze. Alterazioni nel grafico, come picchi o riduzioni in determinate frazioni, possono indicare condizioni patologiche. Un aumento delle gamma globuline, ad esempio, può suggerire una risposta immunitaria attiva, mentre una diminuzione dell’albumina potrebbe essere segno di malnutrizione o malattie epatiche.

Elettroforesi Proteica alta: cosa significa?

Quando si parla di elettroforesi proteica alta, ci si riferisce a un aumento di una o più frazioni proteiche rispetto ai valori normali. Questo può indicare condizioni come infezioni croniche, infiammazioni sistemiche o malattie autoimmuni. In alcuni casi, un tracciato elettroforetico alterato può essere il primo segnale di patologie gravi come il mieloma multiplo, una forma di tumore che colpisce le plasmacellule.

L’interpretazione del tracciato elettroforetico richiede competenze specialistiche, poiché ogni alterazione deve essere valutata nel contesto clinico del paziente. È per questo che è importante rivolgersi a un laboratorio qualificato per eseguire l’esame.

Quando il tracciato è alterato

Un tracciato elettroforetico alterato può indicare diversi problemi di salute. Ad esempio, un picco nella zona delle gamma globuline può indicare un’infezione o un’infiammazione cronica, mentre un aumento delle beta globuline può essere associato a problemi epatici o renali. In caso di alterazioni significative, il medico può richiedere ulteriori esami per approfondire la diagnosi.

Quando fare l’esame di Elettroforesi Proteica

Perché è importante monitorare le sieroproteine?

Le sieroproteine sono essenziali per la salute generale del corpo. Alterazioni nei loro livelli possono avere conseguenze significative, influenzando il sistema immunitario, la coagulazione del sangue e la capacità di trasportare nutrienti. Monitorare regolarmente l’elettroforesi delle sieroproteine è fondamentale per prevenire e trattare condizioni potenzialmente gravi.

In quali casi è necessario?

L’esame elettroforesi delle proteine sieriche è spesso consigliato quando si sospettano condizioni come infezioni croniche, malattie del fegato, problemi renali o disturbi autoimmuni.

Elettroforesi su Gel: Procedura Dettagliata

L'elettroforesi è una tecnica che permette di separare, mediante l'applicazione di un opportuno campo elettrico, molecole presenti in soluzione sotto forma di specie elettricamente cariche. Lo spessore dei vetri utilizzati per questo esperimento è di 0,75 mm. Nella fase di montaggio bisogna assicurarsi che i vetri siano ben allineati in basso; ciò eviterà, durante la fase di versamento del gel, che il liquido fuoriesca. Tenere ben presente che i vetri si montano tenendo quello con il profilo dentellato con il verso opposto a quello dell'operatore, cioè verso l'interno. Ricordare che prima si carica il running gel (fino a circa ½ centimetro di distanza dai pozzetti) e poi lo stacking gel.

Si mescolano bene i componenti e si versa il gel appoggiando la pipetta su uno degli angoli dei vetrini cercando di non formare bolle d’aria, fino a circa ½ cm dal livello precedentemente segnato. Mettere poi dell’acqua distillata fino al bordo superiore del vetrino. A polimerizzazione avvenuta del running gel, si asciuga l’acqua soprastante con della carta assorbente e si versa lo stacking gel con le stesse precauzioni viste prima per evitare le bolle d’aria.

Dopo la polimerizzazione dello stacking gel, infilare il tutto nelle apposite guide nel supporto portaelettrodi. Versare il running buffer prima nello spazio tra le due coppie di vetri, assicurandosi della perfetta tenuta, e poi all’esterno, nella vasca. Quando si è pronti per seminare i pozzetti, si potrà aggiungere il buffer fino in cima.

Quando si è pronti per la semina, si aggiunge il running buffer fino in cima, in maniera tale da sommergere completamente i pozzetti. Si seminano solo quelli in buono stato (quelli integri e con i bordi molto netti) con una siringa Hamilton; per ogni pozzetto si utilizzano circa 15 μL (con i vetri spessi 0,75 mm) di campione diluito secondo le istruzioni già descritte. Si fa correre a V costante (120V) per circa 1 ora. Quando il fronte del colorante è arrivato in fondo, si ferma la corsa.

Si stacca prima di tutto la corrente (IMPORTANTE) e si aprono delicatamente i vetrini. Il gel viene posto nello staining (ad esempio il Blu Coomassie) oppure, se si deve procedere con il western blotting, viene prima posto nel tampone di trasferimento (transfer buffer).

Coprire il gel con la soluzione colorante, chiudere in una scatola di plastica e lasciare circa 30 - 40 minuti. Decolorare con la miscela decolorante così formulata: 400 mL di metanolo, 100 mL di acido acetico e 500 mL di acqua deionizzata, sotto agitazione tutta la notte.

Elettroforesi dell’Emoglobina

L’elettroforesi dell’emoglobina sfrutta il principio della migrazione differenziale delle proteine in un campo elettrico. Durante il test, un campione di sangue viene applicato su una striscia di gel o cellulosa porosa. Quindi, una corrente elettrica viene applicata attraverso la striscia, causando la migrazione delle diverse molecole di emoglobina sulla base della loro carica elettrica e delle loro dimensioni molecolari.

Poiché ciascuna variante di emoglobina ha una carica e una dimensione specifiche, esse si separano in bande distintive sulla striscia. Questo test è particolarmente utile nella diagnosi precoce delle patologie del sangue, consentendo ai medici di iniziare il trattamento tempestivamente e di monitorare l’efficacia delle terapie nel corso del tempo.

L’elettroforesi dell’emoglobina è fondamentale per diagnosticare diverse forme di anemia ereditaria, tra cui l’anemia falciforme, la talassemia e altre emoglobinopatie.

La HbA rappresenta la forma normale di emoglobina negli adulti ed è composta da due catene alfa e due catene beta. Livelli normali di HbA indicano una produzione di emoglobina normale. L’HbA2 è una variante normale dell’emoglobina, composta da due catene alfa e due catene delta. L’HbF è l’emoglobina presente nei neonati e nei feti ed è composta da due catene alfa e due catene gamma.

L’elettroforesi dell’emoglobina può identificare varianti patologiche come l’HbS (emoglobina falciforme) e l’HbC (emoglobina C). L’HbH è una variante dell’emoglobina composta da quattro catene beta.

Nell’interpretazione dei risultati, i picchi e le bande sull’elettroforesi indicano le diverse varianti di emoglobina. L’interpretazione dei risultati deve tenere conto delle informazioni cliniche del paziente, tra cui la storia familiare di malattie del sangue, sintomi presenti e risultati di altri esami di laboratorio.

Sequenziamento del DNA

Sequenziare il DNA significa determinare l’ordine dei nucleotidi, le unità che lo compongono. Con sequenziamento del DNA si intende in effetti il processo con il quale si può stabilire l’ordine dei nucleotidi che compongono una molecola di DNA. I nucleotidi sono gli elementi che costituiscono gli acidi nucleici (il DNA o l’RNA) e sono formati da 3 porzioni: due non variano e sono sempre uno zucchero (il deossiribosio nel DNA e il ribosio nell’RNA) e un gruppo fosfato, mentre la terza, una base azotata, può essere di 4 tipi diversi. Le basi azotate del DNA sono l’adenina (A), la citosina (C), la guanina (G) e la timina (T). Quest’ultima è sostituita dall’uracile (U) nell’RNA.

Il DNA è fatto di due filamenti avvolti tra loro, i cui legami si formano proprio tra le basi azotate, e in particolare tra A e T e tra C e G. Anche per questo si parla di complementarità delle basi. Sequenziando un segmento di DNA arriviamo quindi a conoscere l’ordine delle sue basi.

Oggi il sequenziamento del DNA è una tecnica comune, utilizzata in molti ambiti, tra cui:

nella ricerca, per esempio per studiare lo sviluppo e l’evoluzione delle specie;
nei test prenatali, per rilevare possibili mutazioni ereditarie che possono far aumentare il rischio di determinate malattie anche tumorali;
per caratterizzare gli agenti patogeni e trarre informazioni utili contro epidemie e pandemie, come accaduto di recente per il virus SARS-CoV-2 responsabile della malattia COVID-19;
nell’ambito del cancro, il sequenziamento del DNA può essere utilizzato con diversi scopi, sia clinici sia di ricerca, per la diagnosi e il monitoraggio della malattia e per lo sviluppo di terapie mirate.

Il metodo di sequenziamento di Sanger, ancora oggi utilizzato in determinate circostanze, si basa sulla sintesi da parte dell’enzima DNA polimerasi di catene di DNA di varia lunghezza e sull’uso di dideossinucleotidi trifosfato (ddNTP). Con questo metodo sono dunque necessarie 4 reazioni, una per ogni nucleotide, per stabilire tutte le posizioni dei 4 elementi costituenti all’interno del DNA.

I frammenti ottenuti, tutti di lunghezze differenti, vengono poi separati in base alla loro dimensione mediante una tecnica chiamata elettroforesi su gel. In seguito, grazie all’uso di una particolare pellicola, è possibile visualizzare la posizione dei frammenti e leggere la sequenza del filamento.

Il Progetto Genoma Umano, iniziato nel 1990, ha portato a una prima bozza della sequenza dei geni della nostra specie nel 2001 e al suo quasi totale completamento nel 2003.

Per stabilire la sequenza di nucleotidi di una molecola di DNA, o dell’intero genoma di un organismo, si usano essenzialmente variazioni sugli stessi principi tecnologici, con importanti differenze. È innanzitutto necessario spezzettare le molecole di DNA in una serie di frammenti, che nell’insieme formano quella che viene chiamata libreria. Dopo questo passaggio si va a determinare la sequenza dei diversi frammenti passando di solito attraverso un processo di amplificazione di ciascun frammento tramite PCR, ottenendo così quantità di DNA adeguato a procedere con il sequenziamento.

Una volta ottenuta la sequenza di ciascun frammento, il lavoro non è finito: occorre capire come sono disposti tra loro i diversi pezzi letti, tramite appositi programmi informatici che aiutano a ricostruire la sequenza completa. Questo passaggio può essere difficoltoso a causa della complessità del genoma.

Le innovazioni nella bioinformatica sono fondamentali per il progresso dei sequenziamenti del DNA, perché i milioni di dati ottenuti devono essere non solo letti e interpretati, ma anche catalogati e conservati affinché possano essere consultati e studiati.

I metodi di sequenziamento sviluppati inizialmente da Sanger sono stati affiancati e in parte superati dalle cosiddette tecniche di nuova generazione, o Next Generation Sequencing (NGS). Poiché le macchine di NGS possono processare moltissime provette in parallelo, è possibile ottenere il sequenziamento di migliaia di frammenti di DNA allo stesso tempo.

Ancora più recenti sono le tecnologie di terza generazione, che offrono diversi vantaggi: uno tra tutti, la possibilità di leggere frammenti anche molto lunghi senza che sia necessario frammentarli né amplificarli.