Elettroforesi Proteica: La Chiave Rivoluzionaria per Diagnosticare la Leishmaniosi Canina

La leishmaniosi è una malattia zoonotica diffusa nei paesi del Mediterraneo, causata dal protozoo Leishmania Infantum e trasmessa da insetti ematofagi del genere Phlebotomus, comunemente chiamati "pappatacei" o flebotomi. I Pappataci, tramite il pasto di sangue, veicolano al cane il protozoo Leishmania infantum. Leishmania infantum è un protozoo parassita dei canidi (volpi e cani) e anche dei gatti. Il ciclo di trasmissione di L. Infantum inizia quando un flebotomo infetto punge un cane infetto e assume il parassita sotto forma di amastigote.

Nei successivi 4-20 giorni, all’interno del pappataceo il parassita si replica e si trasforma nella forma infettante, promastigote, che può essere trasmessa ad altri cani, esseri umani o specie sensibili attraverso una nuova puntura. Originariamente presente nelle zone tropicali e sub-tropicali, con il riscaldamento globale e il trasferimento dei cani infetti al seguito dei proprietari, si è diffusa in tutto il bacino del Mediterraneo, isole comprese. Il periodo di incubazione nel cane può durare anche molti anni.

La leishmaniosi a volte può essere letale, ma per fortuna non ha un decorso fulminante e esiste un modo per tenere sotto controllo i sintomi. Attualmente non ci sono farmaci capaci di debellare i protozoi, possono solo controllare malattia e sintomi. Il periodo della cura è di almeno 6 mesi, una terapia lunga che in ogni caso va adattata allo stato di salute del cane.

I cani fungono da serbatoio di Leishmania infantum. Utilizzare prodotti ad azione repellente nei confronti dei flebotomi con conseguente riduzione del rischio di contagio (Antiparassitari contro pulci e zecche). Il protocollo del vaccino contro la leishmaniosi prevede la sua somministrazione in tre iniezioni sottocutanee, a distanza di 3 settimane l’una dall’altra, seguite da un richiamo del vaccino annuale. Per tutti gli animali con tendenze ad avere reazioni allergiche o di ipersensibilità ai vaccini, esiste un protocollo di sicurezza.

Il vaccino contro la leishmaniosi può per noi rappresentare una via non alternativa ma complementare, per cui ricordiamo i metodi già a disposizione, terapeutici e profilattici per la lotta alla leishmaniosi e ai malefici pappataci. Per la leishmaniosi del cane la diagnosi avviene con gli appositi esami del sangue annuali. Si valutano il grado di anemia e la funzionalità renale ed epatica, c’è l’elettroforesi proteica ad indicare lo stadio della patologia e i test sierologici che valutano la presenza della leishmaniosi del cane.

Metodi Diagnostici

Oltre all'elettroforesi proteica, altri metodi diagnostici includono:

Agoaspirato: Da cui si ricava materiale cellulare che viene utilizzato per cercare materiale molecolare del parassita (dna) tramite la tecnica della PCR.
Tecnica E.L.I.S.A.: La diagnosi in questo caso è valida anche per cani asintomatici.

La diagnosi in questo caso è valida anche per cani asintomatici. prendo un vetrino su cui ho messo dei promastigoti morti e ci metto sopra il siero del mio cane, all’interno del quale, se ci sono anticorpi (dovuti al fatto che il mio cane è infetto e risponde con risposta anticorpale, quindi sarà recettivo), questi andranno a legarsi ai promastigoti presenti.

Risposta Immunitaria e Carica Parassitaria

Th1, Il-2 e interferon gamma, attivano i macrofagi e neutralizzano il parassita oppure arrivano ad un equilibrio per cui leishmania resta allo stato latente. Cani infetti e asintomatici mostrano una risposta cellulo-mediata intensa, mentre quelli sintomatici possiedono una riposta immunitaria prevalentemente umorale. Th2, con aumento IL-4 e IL-10 e diminuzione di IL-2, determinano la soppressione dei macrofagi e stimolazione linfociti B con aumento policlonale produzione di AC.

Il continuo stimolo del parassita sul sistema immunitario turba l’equilibrio umorale, che va in iper-produzione di anticorpi che però non distruggono il parassita. Anche la carica parassitaria riveste un ruolo cruciale nella progressione della leishmaniosi canina. In presenza di elevate quantità di agenti infettivi o parassiti, il sistema immunitario tende naturalmente a polarizzarsi verso una risposta di tipo umorale, fenomeno osservato in diverse malattie fungine, batteriche e protozoarie come istoplasmosi, brucellosi, tubercolosi e lebbra.

Nel caso specifico della leishmaniosi canina, una carica parassitaria più elevata si traduce in una progressione più rapida e forme cliniche più gravi della malattia. Studi in corso presso la Clinica Veterinaria San Marco hanno evidenziato una correlazione tra carica parassitaria e livelli di parametri infiammatori come le proteine di fase acuta. Questo tipo di alterazioni sono però piuttosto aspecifiche e possono risultare come conseguenza dell’attività secretoria delle plasmacellule, variabili a seconda del soggetto, dell’eventuale stadio della malattia, e di altri fattori conseguenti allo stato infiammatorio cronico sistemico, come le concomitanti insufficienze renali con proteinuria spesso irreversibili anche in corso di trattamento., o di patologie concomitanti rickettsiosi, anaplasmosi, ehrilchiosi etc.

Ruolo delle Proteine di Fase Acuta e dell'Elettroforesi delle Sieroproteine

La rilevazione delle proteine di fase acuta (APP) e l’elettroforesi delle sieroproteine sono di supporto alla diagnosi e al monitoraggio. Sebbene non sia specifico della Leishmaniosi, riflette l’entità della risposta infiammatoria e individua alcune differenze con altre patologie, come l’aumento di ferritina circolante, per anomalie metabolismo del ferro.

Test Sierologici

Gli esami sierologici consentono di identificare gli anticorpi specifici generati in risposta a un'infezione, con una produzione significativa che si verifica solitamente tra i 3 e i 6 mesi dall'infezione. I test rapidi, come quelli basati sul metodo ELISA o su tecniche immunocromatografiche, sono semplici da utilizzare in ambulatorio. Sebbene abbiano una specificità elevata, la loro sensibilità è piuttosto bassa.

Questi test sono particolarmente utili nella pratica quotidiana, ma è importante sottolineare che sono progettati per rilevare livelli medi o elevati di anticorpi. Per quanto riguarda i test quantitativi, le due principali tecniche sono l'immunofluorescenza indiretta (IFI) e il test ELISA. L'IFI può essere soggetta a variabilità in base all'operatore e può presentare limitazioni in termini di sensibilità e riproducibilità. Il test ELISA, d'altra parte, è considerato più affidabile e oggettivo, privo di significativi problemi tecnici e, quindi, è raccomandato come metodo di prima scelta.

È importante notare che livelli elevati di anticorpi sono generalmente associati a forme più gravi della malattia e possono quindi essere utili nella stadiazione della patologia. Tuttavia, sia i test qualitativi che quantitativi richiedono un'interpretazione cauta: un risultato positivo non è sempre indicativo di malattia attiva. In conclusione, la leishmaniosi canina è una patologia complessa che richiede un approccio diagnostico integrato, combinando diversi test di laboratorio.

Alterazioni Clinico-Patologiche di Base Associate alla Leishmaniosi

Dal punto di vista laboratoristico, riportiamo di seguito le principali alterazioni clinico patologiche di base che possono associarsi a Leishmaniosi:

Esame Emocromocitometrico

Spesso presente un’anemia scarsamente rigenerativa a seguito di coinvolgimento midollare di Leishmania, ma anche, a motivo dell’andamento a carattere cronico della malattia.
Talvolta può invece essere presente un’anemia rigenerativa su base immunomediata. Parte di questi soggetti, in una percentuale ridotta di casi, risulta positiva all’ANA test od al test di Coombs.
Presente neutrofila matura associata a monocitosi, linfopenia ed eosinopenia (emogramma da stress). Talvolta riportata leucopenia.
Frequentemente identificata trombocitopenia. Tale rilievo può essere la conseguenza di coinfezioni (ad esempio da Ehrlichia), oppure la conseguenza di “consumo” - ad esempio se è presente concomitante DIC - ed infine può essere di origine immunomediata.

Esame Cogulativo

Può verificarsi prolungamento dei tempi della coagulazione (PT ed aPTT).
Può essere presente DIC, se presente trombocitopenia.
Talvolta si identifica iperfibrinogenemia.

Esami Biochimici

Classicamente si rileva iperprotidemia associata ad iperglobulinemia ed ipoalbuminemia, con inversione del rapporto A/G.
L’iperprotidemia, associata alla gammopatia policlonale, rappresenta un valido aiuto nell’ambito del processo diagnostico. Tuttavia è un esame poco specifico, sebbene dotato di elevata sensibilità.
L’ipoalbuminemia può rappresentare una compensazione all’iperglobulinemia, oppure essere la conseguenza di una nefropatia proteino-disperdente.
Incremento degli enzimi epatici.
Iperazotemia con ipercreatininemia, eventualmente associata o meno ad ipoalbuminemia, ipercolesterolemia e proteinuria (sindrome nefrosica).
Eventuale iperfosfatemia ed ipermagnesiemia, con possibili alterazioni elettrolitiche quali ipokaliemia. A volte, a seguito dell’insufficienza renale che si può verificare, si può identificare un’ acidosi metabolica.
Aumento delle proteine di fase acuta (CRP / SAA / aptoglobina).

Elettroforesi delle Proteine Sieriche

Aumento delle gammaglobuline (gammopatia policlonale o oligoclonale) associato ad incremento delle alfa 2 globuline.

Trattamenti e Terapie

Purtroppo, i trattamenti attualmente disponibili spesso non sono in grado di eradicare completamente il parassita, e la guarigione parassitologica rappresenta un risultato molto raro. Gli obiettivi della terapia si concentrano quindi sull’ottenimento di un animale privo di segni clinici e sul mantenimento di questo stato di salute per il più lungo tempo possibile.

La terapia è consigliabile se la dimostrazione diretta del parassita è associata ad un aumento degli anticorpi specifici. In questi casi il titolo anticorpale è solitamente molto più alto rispetto al valore soglia di riferimento. rientrano in questa categoria animali con insufficienza renale cronica o nefropatia proteinuria, gravi malattie oculari che potrebbero comportare la perdita funzionale, gravi malattie concomitanti (di natura infettiva, neoplastica, endocrina, metabolica). cani che non rispondono al trattamento specifico. In questo caso sarebbe opportuno rivalutare il protocollo terapeutico e la correttezza nella somministrazione della terapia. Bisogna anche escludere altre malattie concomitanti che possono influenzare negativamente l’esito della terapia. cani che, dopo un trattamento specifico, presentano precocemente una recidiva.

Il primo farmaco viene somministrato per bocca per almeno 4-6 mesi mentre il Glucantime viene somministrato per un periodo variabile dalle 4 alle 8 settimane. Il Glucantime, come dimostrato da diversi studi, ha una buona efficacia clinica. Permette un miglioramento clinico e dei parametri di laboratorio dopo un periodo variabile di tempo. L’elettroforesi delle proteine può modificarsi più lentamente. Gli effetti collaterali più frequentemente riscontrati sono febbre, diarrea, perdita di appetito, dolore e rigonfiamento locale. La limitazione all’uso del farmaco è dovuta soltanto alla difficoltà di somministrazione per il proprietario. Gli studi clinici, ad oggi, non mostrano evidenza di danno renale indotto dai composti antimoniali.

Lo Zyloric (allopurinolo) viene somministrato per bocca a cicli di 4-6 mesi per tutta la vita dell’animale. La combinazione dei precedenti due farmaci è quella più utilizzata anche se non consente una guarigione parassitologica completa. La miltefosina (Milteforan) viene somministrata per via orale per 28 giorni, quindi di più facile gestione rispetto al Glucantime per alcuni proprietari. Questa molecola non è in grado di eliminare del tutto la Leishmania dai soggetti infetti, anche se gli studi hanno dimostrato una riduzione marcata della carica parassitaria. La sua efficacia aumenta in associazione con l’allopurinolo.

In associazione alle terapie descritte sopra, è sempre possibile utilizzare delle terapie collaterali, ‘non convenzionali’, quali l’omeopatia, l’agopuntura, l’omotossicologia. A seconda del quadro clinico e degli eventuali organi colpiti, si possono utilizzare sia rimedi specifici per il singolo animale che complessi che aiutano sia nel sostenere gli organi che nello stimolare le difese immunitarie dell’animale. A seconda del caso clinico, sarà possibile valutare una strategia piuttosto che un’altra. La frequenza di controllo dei cani dall’inizio della terapia è individuale. Si considerano sempre le condizioni cliniche di partenza prima e dopo il trattamento.

In caso di diagnosi di Leishmaniosi, quindi, non bisogna lasciarsi scoraggiare. Ci sono molte possibilità terapeutiche che permettono di aiutare il nostro cane nel modo migliore.