Elettroforesi del DNA: Guida Completa e Segreti per Risultati Perfetti

L'elettroforesi del DNA è una tecnica che permette di separare frammenti di acido nucleico in funzione del loro peso molecolare. Questa operazione può servire sia a stabilire il numero dei singoli frammenti, con le rispettive dimensioni molecolari, sia a individuare e purificare un frammento di particolare interesse.

Tecnologia del DNA Ricombinante

Si definisce tecnologia del DNA ricombinante l’insieme delle tecniche di laboratorio che consentono di isolare e tagliare brevi sequenze di DNA per trasferirle e inserirle nel genoma di altre cellule, in modo da modificarne uno o più geni. Questa tecnologia permette interventi mirati, che modificano in modo specifico solo i geni dei caratteri su cui si vuole agire.

Inoltre, le metodologie odierne consentono di trasferire DNA non solo tra individui della stessa specie, ma anche tra specie diverse, spesso molto differenti l’una dall’altra. Il primo passaggio consiste sempre nel tagliare il DNA. Talvolta questa operazione serve solo per studiare meglio le caratteristiche dei frammenti ottenuti, ma il più delle volte è la premessa per una ricombinazione: si uniscono cioè molecole di DNA di provenienza diversa.

Enzimi di Restrizione e Ligasi

Per tagliare e ricucire i geni sono necessari enzimi specifici (enzimi di restrizione e ligasi). Gli enzimi di restrizione possono venire isolati ed estratti dalle cellule che li producono per essere utilizzati in laboratorio come se fossero delle «forbici biochimiche». Oggi disponiamo di centinaia di enzimi di restrizione, purificati a partire da vari microrganismi.

Perciò uno stesso campione di DNA può venire tagliato da più enzimi che riconoscono siti di restrizione diversi. In questo modo i biologi molecolari possono scegliere con precisione chirurgica dove tagliare un campione di DNA optando tra molti siti diversi. Poiché le sequenze di riconoscimento non si presentano a intervalli regolari, i frammenti di restrizione hanno lunghezze diverse, ed è proprio grazie a questa variabilità che li possiamo separare.

Come Funzionano gli Enzimi di Restrizione

La maggior parte degli altri enzimi di restrizione lavora riconoscendo sequenze palindrome e operando un taglio «obliquo» nel filamento di DNA. Gli enzimi di restrizione agiscono solo sul DNA estraneo e non tagliano mai il DNA della cellula batterica che li ha prodotti.

L’enzima EcoRI è formato da due subunità contenenti due siti attivi identici, che tagliano contemporaneamente i due filamenti tra le basi G e A. In un tipico genoma procariotico, la sequenza di riconoscimento per EcoRI si trova in media una volta ogni 40000 coppie di basi (ossia una volta ogni quattro geni).

Perciò questo enzima può tagliare un grosso pezzo di DNA in frammenti più piccoli che contengono, in media, soltanto pochi geni. L’espressione «in media» non significa che l’enzima tagli tutti i frammenti a intervalli regolari. Nelle 40000 coppie di basi del fago T7, per esempio, la sequenza di riconoscimento per EcoRI non compare neppure una volta, un fatto di vitale importanza per il virus, dato che il suo ospite è proprio E.

Oggi gli enzimi di restrizione si utilizzano per studiare sia il genoma dei batteri sia quello delle cellule eucariotiche. Nel caso dell’uomo, frammentando e analizzando il DNA di un enorme numero di cellule è stato possibile verificare che ciascun individuo possiede una propria «impronta genetica».

Il DNA frammentato, infatti, ha caratteristiche diverse da persona a persona: esistono però delle somiglianze tra consanguinei, in particolare tra genitori e figli. Tale tecnica di tipizzazione del DNA è utile per identificare le persone, stabilire rapporti di parentela e cercare geni responsabili di malattie ereditarie.

Polimorfismi e Ripetizioni Tandem

Per identificare una persona o stabilire parentele sono molto adatti i geni polimorfi, che presentano vari alleli e pertanto hanno un’alta probabilità di essere diversi nei singoli individui. I polimorfismi da singolo nucleotide (SNP) sono variazioni che riguardano un’unica base nucleotidica.

Le ripetizioni brevi in tandem (STR) sono tratti di DNA contenenti sequenze di 2-10 basi che si ripetono più volte, una di seguito all’altra, secondo uno schema preciso. Anche questi schemi di ripetizione sono ereditari: per esempio, un soggetto può ereditare dalla madre un cromosoma 15 con una breve sequenza ripetuta sei volte e dal padre un altro cromosoma 15 con la stessa sequenza ripetuta due volte.

Se una STR si trova tra due sequenze di riconoscimento per un enzima di restrizione, il DNA dell’individuo eterozigote tagliato da tale enzima darà origine a due frammenti di lunghezza diversa: uno più grande (materno) e uno più piccolo (paterno). La differenza è osservabile con l’elettroforesi su gel.

Tuttavia, non è sempre possibile raggiungere dei risultati sicuri. La determinazione dell’impronta genetica richiede almeno 1 µg di DNA, corrispondente a quello contenuto in circa 100 000 cellule umane: una quantità non sempre disponibile.

Fortunatamente, è possibile amplificare il DNA che ci interessa e ottenere così la quantità necessaria per effettuare la digestione da restrizione e l’elettroforesi. Da quando è stata ottenuta la duplicazione del DNA in laboratorio, è possibile fare copie multiple di una sequenza di DNA.

La Tecnica della PCR

La tecnica della PCR richiede la conoscenza delle sequenze di basi all’estremità 3' di ciascun filamento della sequenza bersaglio, in modo da costruire in laboratorio il primer complementare, di solito della lunghezza di 15-20 basi. Data la peculiarità di questa sequenza, nel genoma di un organismo di solito ci sarà una sola regione del DNA a cui potranno legarsi due primer di questa lunghezza.

All’inizio esisteva un problema con la PCR: i requisiti termici. Per denaturare il DNA, infatti, bisogna scaldarlo a più di 90 °C, una temperatura che distrugge la DNA polimerasi. Il problema è stato risolto dalla natura: in alcuni geyser, come anche in altre sorgenti termali, vive un batterio chiamato Thermus aquaticus.

Portando avanti una ricerca di base, Thomas Brock e i suoi collaboratori scoprirono che questo organismo poteva sopravvivere a temperature fino a 95 °C grazie a un apparato metabolico termoresistente, completo di una DNA polimerasi (chiamata Taq polimerasi o polimerasi termostabile) che non si denatura ad alte temperature. Dopo aver letto l’articolo di Brock, il biochimico statunitense Kary Mullis pensò di usare la Taq polimerasi per la PCR; l’idea funzionò, tanto da fruttargli il premio Nobel nel 1983.

DNA Ligasi e Ricombinazione

Tutte le cellule contengono enzimi chiamati DNA ligasi che durante il processo di duplicazione del DNA uniscono i frammenti di Okazaki. Quando i biologi riuscirono a isolare tali enzimi, si resero conto che potevano essere utili per saldare insieme due sequenze qualsiasi di DNA.

Nel 1973, Stanley Cohen e Herbert Boyer tagliarono con enzimi di restrizione e poi unirono con una DNA ligasi due plasmidi di E. coli, ciascuno contenente un gene per la resistenza agli antibiotici. Il plasmide risultante, una volta reinserito in cellule di E. coli, le rese resistenti a entrambi gli antibiotici.

Sappiamo che molti enzimi di restrizione effettuano tagli sfalsati a livello di una sequenza di riconoscimento palindroma. In questo caso, i frammenti di restrizione terminano con due estremità a filamento singolo.

Dal momento che contengono estremità coesive complementari, i frammenti di restrizione possono unirsi tra loro in seguito alla formazione di legami a idrogeno tra le basi, indipendentemente dalla loro origine: ciò avviene grazie alle DNA ligasi, che stabilizzano i legami tra frammenti adiacenti unendo l’estremità 5' di uno di essi con l’estremità 3' di quello vicino.

Utilizzando questi enzimi, i biologi molecolari riescono a produrre DNA ricombinante «tagliando e cucendo» molecole di DNA provenienti dalle fonti più diverse.

Elettroforesi su Gel: Principio e Procedura

Il gel è posto in uno stampo di forma rettangolare; a una delle estremità del gel si trovano delle piccole cavità verticali chiamate pozzetti, allineate a formare una fila. A pH neutro, il DNA è carico negativamente grazie alla presenza dei gruppi fosfato; poiché le cariche opposte si attraggono, i frammenti di DNA migrano verso il polo positivo del campo elettrico.

Il gel funziona da «setaccio molecolare»: le molecole piccole, infatti migrano attraverso l’agarosio più velocemente di quelle grandi. Una sequenza nota può essere messa in evidenza all’interno del campione mediante l’uso di una sonda di DNA marcata con una sostanza radioattiva.

Il campione di DNA viene denaturato (cioè despiralizzato e separato in filamenti singoli) quando è ancora nel gel e immobilizzato. In seguito, il campione viene esposto a una sonda di DNA a singolo filamento contenente una sequenza complementare a quella cercata.

Se nel campione di DNA è presente la sequenza che ci interessa, la sonda si unirà ad essa. A ibridazione avvenuta, una macchia di radioattività indicherà il punto in cui la sonda ha intercettato la sequenza di DNA desiderata, mentre le sonde che non si sono legate rimarranno nella soluzione.

DNA Fingerprinting: Applicazioni Forensi

L'esperimento si inserisce nel programma di biotecnologia delle classi quinte con l'obiettivo di sviluppare una conoscenza di base della tecnica del DNA Fingerprinting. Il DNA fingerprinting (o impronta genetica o DNA profiling) è una tecnica ampiamente usata, dall'ambito medico a quello forense, per l'idenitificazione di un soggetto.

L'esperimento ripropone i passaggi principali dei primi test di fingerprinting che consistevano in: digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e successiva visualizzazione delle bande di DNA. Il DNA fingerprinting si basa sull'analisi di marcatori STR (Short Tandem Repeats o microsatelliti) presenti nel genoma di ogni individuo.

Gli STR consistono di brevi sequenze di DNA (10-50 paia di basi) ripetute in tandem numerose volte e presenti in diversi cromosomi. Il numero di ripetizioni è altamente variabile nei diversi individui, ma è costante in ogni profilo e segue un pattern di ereditarietà mendeliana.

L’elettroforesi è una tecnica che permette di separare frammenti di acido nucleico, in funzione del loro peso molecolare. Frammenti di DNA (carichi negativamente per la presenza dei gruppi fosfato) in un campo elettrico migrano verso il polo positivo e migrano tanto più velocemente quanto più sono piccoli. In questo modo dal DNA è possibile ottenere un profilo genetico specifico per ciascun individuo.

Caso Pratico: Simulazione di una Scena del Crimine

Viene simulata una scena del crimine in cui, a seguito di un omicidio, viene rinvenuta un'arma con delle tracce di sangue sull’impugnatura. In questo modo dal DNA è possibile ottenere un profilo genetico specifico per ciascun individuo e quindi confrontare il profilo genetico della scena del crimine con quello dei sospettati ed arrivare ad identificare il colpevole.

Il caso proposto: tra giovedì e venerdì nell'edificio del liceo è stato commesso un omicidio. Il sabato mattina è stato trovato il cadavere di un collaboratore scolastico. Il medico legale ha riscontrato sul cadavere numerose ferite da arma da taglio e durante il sopralluogo della scena del crimine è stato rinvenuto un coltello con tracce di sangue sull’impugnatura, che sono state repertate e prelevate.

Preparazione dell'Esperimento

Prima dell’esperimento vero e proprio con i ragazzi, il tecnico di laboratorio deve fare varie azioni preliminari:

Reidratare i vari campioni di DNA (che è liofilizzato e tenuto in freezer).
Reidratare il Ladder (DNA di taglia nota).
Reidratare gli enzimi di restrizione.
Aliquotare DNA per 6 postazioni (10 µl each).
Aliquotare Loading Dye per 6 postazioni.
Aliquotare enzimi di restrizione per 6 postazioni.
Diluire TAE 1X.
Diluire FAST BLAST DNA stain a 100X.
Versare 2 gel 1% agarosio (volume circa 100 ml).
Allestire le 6 postazioni per i 6 gruppi di studenti.

L'esperimento si compone di quattro parti e necessita di tre ore di laboratorio che possono essere spezzate in due giorni diversi avendo l’accortezza di mantenere il gel umido:

I parte: reazione di digestione con enzimi di restrizione
II parte: preparazione del gel di agarosio
III parte: preparazione dei campioni e corsa elettroforetica
IV parte: colorazione del gel mediante Fast Blast DNA Stain

I Parte: Reazione di Digestione con Enzimi di Restrizione

Trasferire 10 μl di Enzyme Mix (provetta marcata ENZ) in ciascuna delle 5 eppendorf contenenti i seguenti DNA:
- CS: crime scene (traccia ematica sul manico del coltello)
- V: DNA estratto della vittima
- S1: sospettato 1
- S2: sospettato 2
- S3: sospettato 3
ATTENZIONE:
- Sincerarsi che il campione di DNA sia sul fondo della provetta.
- Cambiare puntale per ogni campione.
- Pipettare più volte lentamente per mescolare il campione.
Chiudere bene le provette, «flickare» per mescolare, far scendere sul fondo la miscela di reazione mediante centrifugazione (o utilizzare la minicentrifuga).
Marcare le provette con il numero del gruppo, inserirle negli alloggiamenti galleggianti e incubare la reazione a 37°C per 45 min.

II Parte: Preparazione del Gel d'Agarosio

Utilizzando le apposite barriere (in dotazione con alcune camere da elettroforesi e chiamate gel caster) o lo scotch di carta, sigillare entrambe le estremità di una vaschetta per gel. Inserire gli appositi pettini per la formazione dei pozzetti e assicurarsi che sia in posizione perfettamente orizzontale (in bolla).

Per ottenere una concentrazione di agarosio del 1% p/v, mescolare in una beuta 1 g di agarosio con 100 ml di TAE 1x (Tris-Acetato EDTA). Il TAE è una soluzione tampone ricca di sali, che serve per condurre la corrente elettrica e controllare il pH durante l’elettroforesi.

Sciogliere l’agarosio in un forno a microonde o su una piastra riscaldante, mescolando di tanto in tanto e facendo attenzione a non far bollire la soluzione. L’agarosio si scioglie in acqua con temperature sopra i 70°C.

Quando la soluzione sarà completamente trasparente, attendere qualche minuto per farla raffreddare fino a circa 50°. Versare il gel nell’apposita vaschetta con pettini, facendo attenzione a non formare bolle. Aspettare circa 30 minuti perché raffreddandosi il gel polimerizza.

Una volta che il gel è polimerizzato, togliere le eventuali spondine utilizzate per contenere il gel, togliere il pettine per la formazione dei pozzetti e ricoprire il gel con il tampone di corsa TAE 1x.

III Parte: Preparazione dei Campioni e Corsa Elettroforetica

Rimuovere i campioni dall’incubatore e se necessario centrifugarli.
Aggiungere 5 μl di “Loading Dye” (LD) in ciascuna delle 5 eppendorf contenenti i DNA. Il LD è il tampone di caricamento costituito da un colorante blu + un addensante (glicerolo) che si aggiunge ai campioni prima dell’elettroforesi. Serve ad “appesantire” i campioni, permettendo la loro permanenza nei pozzetti e a fornire un marker visivo del progredire della corsa elettroforetica (segnala il fronte della corsa). Infatti poiché DNA è "trasparente", se si caricassero i campioni sul gel senza il tampone, avviando l'elettroforesi non si riuscirebbe a rendersi conto di quanto si sono spostati i frammenti di DNA e si correrebbe il rischio di farli "uscire" dalla parte bassa del gel (magari perdendo delle bande importanti). Il LD è una sostanza colorata molto leggera e carica negativamente che migra più velocemente di qualunque frammento di DNA.
Mescolare pipettando o «flickando». Centrifugare se il campione è rimasto sulle pareti.
Caricare 20 μl di ciascun campione di DNA nei pozzetti del gel annotando l’ordine di caricamento e il gruppo. Questa operazione è delicata perché se non si è pratici si rischia o di bucare il pozzetto o di rilasciare il DNA prima di entrare nel pozzetto. Quindi è preferibile in un momento precedente far esercitare gli alunni all’uso della micropipetta facendo prelevare piccoli quantitativi di una soluzione colorata (orange).
Chiudere il coperchio dell’alimentatore, accendere l’alimentatore e verificare il passaggio di corrente attraverso l’emissione di bolle in prossimità degli elettrodi. La corsa elettroforetica necessita di un voltaggio di circa 12-15 V/cm. Per un gel di 8 cm di lunghezza il voltaggio è di 100 V.
Quando il fronte di migrazione indicato dal Loading Dye (LD) raggiunge la fine del gel (circa 30 minuti) staccare l’alimentatore e procedere alla colorazione per la visualizzazione delle bande.

IV Parte: Colorazione del Gel mediante Fast Blast DNA Stain

Una volta arrestata la corsa elettroforetica, estrarre il gel e immergerlo in una vaschetta contenete il colorante Fast Blast DNA ad una concentrazione di 100x per circa 2 minuti, agitando lentamente.

Trasferire il gel in un nuovo contenitore. Si suggerisce di tagliare ognuno dei due gel, ottenuti nelle due camere, in tre parti in modo tale che ogni gruppo abbia il proprio gel su un contenitore. Trasferire con cautela ogni porzione di gel in una vaschetta e sciacquarlo con acqua a 40-55°C per circa 10 secondi.

Decolorare il gel mediante due lavaggi in acqua calda di 5 minuti ciascuno, sempre agitando lentamente e con cautela.

Osservazioni e Conclusioni

Osservare dopo un po’ la comparsa delle bande. Confrontare il profilo genetico della scena del crimine con quello dei tre sospettati. Negli ultimi anni, la genetica ha acquisito sempre più importanza nell'ambito delle scienze forensi.

Questo grazie all’accrescimento delle conoscenze sul genoma umano e allo sviluppo di tecniche analitiche. La conoscenza e l’analisi delle sequenze del genoma umano che presentano differenze interindividuali permette di definire un profilo genetico unico per ogni individuo.

Se si escludono infatti i gemelli monovulari, la probabilità di avere due profili genetici identici, con il livello di sensibilità oggi disponibile, è dell’ordine di 1 su $10^{16}$ (un milione di terre con la stessa popolazione umana).

Un Esempio Storico: Il Caso di Colin Pitchfork

Il 10 settembre 1984 Alec Jeffrey, genetista britannico, fece il primo DNA fingerprinting della storia. Il primo caso giudiziario risolto con il DNA fingerprinting fu l'identificazione dell'assassino di due ragazze adolescenti, entrambe di 15 anni, Lynda Mann e Dawn Ashworth, rapite e uccise a Narborough (Inghilterra) rispettivamente nel 1983 e nel 1986.

A seguito di analisi di campioni di sperma prelevati dai corpi delle due ragazze, Colin Pitchfork, vista la corrispondenza tra i profili genetici dei campioni e il suo DNA, fu identificato e condannato per il loro omicidio.