Elettroforesi delle Proteine: Scopri i Segreti, i Principi Fondamentali e le Applicazioni Sorprendenti!

L’elettroforesi è una tecnica utilizzata per separare macromolecole cariche, consentendo la distinzione delle stesse in base alle loro dimensioni o alla carica elettrica che le contraddistingue.

Cos'è l'Elettroforesi?

L’elettroforesi è una tecnica analitica che consente la separazione in liquido di macromolecole cariche, poste in un campo elettrico, attraverso la migrazione differenziale delle stesse in matrice di agarosio o poliacrilamide. Questa tecnica consente quindi la separazione di proteine e acidi nucleici in base alle dimensioni e/o cariche delle molecole in questione.

Il principio chimico-fisico su cui si basa l’elettroforesi consiste nella risposta che molecole cariche producono se immerse in un campo elettrico: queste, infatti, tenderanno a muoversi lungo le linee del campo di modo che gli ioni positivi migrino verso il polo negativo e quelli negativi verso il polo positivo.

La mobilità delle molecole varia in base alle dimensioni, alle cariche elettriche e alle forme delle molecole, alla differenza di potenziale associata al campo elettrico applicato e alla natura del materiale di cui è composto il gel.

Dove Ue è la mobilità elettroforetica, ε la costante dielettrica, ζ il potenziale zeta, f(ka) la funzione di Henry e η la viscosità del solvente. Mentre la costante dielettrica quantifica la tendenza del materiale a contrastare l’intensità del campo elettrico applicato, il potenziale zeta prende in considerazione le due fasi differenti all’interno della cella elettrolitica: quella liquida nella quale sono presenti le molecole da analizzare e quella solida costituita dai due elettrodi che vengono raggiunti dalle diverse molecole durante la corsa elettroforetica. Il potenziale zeta, infatti, è la tensione che si genera dalla formazione di un doppio strato elettrico e quindi di un’interfaccia solido-liquido in corrispondenza della quale si instaura un trasferimento di carica.

Elettroforesi delle Proteine

L’elettroforesi delle proteine è la tecnica più ampiamente utilizzata in tutti i laboratori di biochimica. Essa è utile per lo studio di soluzioni delle quali si vuole analizzare il contenuto proteico: l’osservazione della migrazione delle diverse molecole, infatti, fornisce uno spettro finale che rispecchia le caratteristiche delle proteine presenti in soluzione.

La caratteristica principale per cui si distingue l’elettroforesi proteica da quella volta all’analisi del DNA sta nella matrice: quella più usata per lo studio dei polipeptidi è la poliacrilamide, da cui deriva il nome PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis, con cui si indica il processo di elettroforesi proteica. Vengono impaccati due gel con distinte porosità, ottenuti facendo co-polimerizzare acrilamide con metilenbisacrilamide.

Il gel di impaccamento, o stacking gel, serve a favorire la concentrazione del campione in una zona molto stretta del gel per migliorare la risoluzione delle bande, prima di entrare nel gel di corsa.
Il gel di corsa, o running gel, è necessario per ottenere la separazione delle proteine.

Per visualizzare la traccia elettroforetica, infine, si può utilizzare il colorante Coomassie brilliant blue R-250 oppure la tecnica del silver staining.

Nel primo caso il gel viene immerso nella soluzione colorante così che si formino interazioni ioniche tra i gruppi solfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine, oltre a interazioni di Van der Waals. L’eccesso di colorante viene eliminato immergendo il gel in una soluzione di etanolo e acido acetico.
Nel secondo caso le proteine sono trattate in modo da diventare sensibili all’argento e poi con un sale dello stesso metallo (in genere nitrato). Una soluzione di sviluppo contenente formaldeide fa precipitare l’argento legato alle proteine riducendo i cationi ad argento metallico. La riduzione viene poi fermata con EDTA.

Tipi di Elettroforesi delle Proteine

Esistono vari tipi di elettroforesi di proteine. E’ possibile separare le proteine in condizioni native sulla base delle dimensioni e della carica (elettroforesi nativa), per punto isoelettrico (isoelettroforesi), oppure solamente in base alle loro dimensioni (SDS-PAGE). In ogni caso bisogna considerare che la velocità di migrazione sarà sempre direttamente proporzionale al campo elettrico applicato e alla carica della molecola, mentre risulterà inversamente proporzionale alla viscosità del mezzo e alle dimensioni della molecola (massa molecolare e forma).

Altro tipo di elettroforesi proteica è quella capillare: sono utilizzati tubi sottili e stretti di diametro interno compreso fra i 20 e i 100 micron, di modo che il calore possa essere velocemente dissipato per poter usare campi elettrici molto alti con la contemporanea riduzione dei tempi di separazione ad alcuni minuti.

SDS-PAGE

L’elettroforesi SDS-PAGE consiste in un tipo di corsa elettroforetica in cui le molecole proteiche vengono distinte esclusivamente in base alla loro massa. Il nome di questo tipo di tecnica ci indica il suo principale componente: il sodio dodecil-solfato (SDS).

L’SDS è un tensioattivo che in presenza di proteine ne rompe i legami non-covalenti denaturandole e quindi privandole della loro forma originaria. Al campione viene aggiunto, inoltre, beta-mercapto-etanolo, che agisce da secondo denaturante rompendo i ponti disolfuro della proteina, e somministrato calore. L’estremità anionica della molecola di SDS lega i residui amminoacidici della proteina impartendo ad essa una notevole carica negativa. In questo modo alle proteine denaturate si impartisce una carica che possa uniformarle tutte.

Sappiamo che, dati specifici valori di campo elettrico e di viscosità del mezzo, a parità di carica, migrerà più velocemente la molecola di raggio minore: per questo spesso viene scelta la SDS-PAGE, poiché permette di confrontare le proteine esclusivamente per quella che è la loro massa. Una volta terminato il processo di elettroforesi il gel di poliacrilamide viene posto all’interno di una soluzione di colorante, in questo caso di Coomassie brilliant blue R-250.

Isoelettroforesi (IEF)

L’isoelettroforesi, o isoelettrofocalizzazione (IEF), oppure ancora focalizzazione isoelettrica, sfrutta il punto isoelettrico caratteristico di ciascuna proteina per distinguere le molecole nella loro corsa sulla matrice di gel.

Il punto isoelettrico di una molecola corrisponde a quel valore di pH per cui, se in elettroforesi, la molecola smette di migrare e si ferma. Considerando che una proteina, essendo costituita da amminoacidi, e quindi da potenziali zwitterioni, possiede entrambe le polarità, ciascun polipeptide ha un suo proprio punto isoelettrico (pI) in corrispondenza del quale si ferma in elettroforesi.

Se si sottopone una miscela di proteine a elettroforesi attraverso una soluzione o un gel con un gradiente stabile di pH, in cui il pH aumenta in modo regolare dall’anodo al catodo, ciascuna proteina migrerà fino alla posizione corrispondente al suo pI. Il campione è prima sottoposto a IEF in una direzione, quindi le molecole proteiche vengono distinte mediante SDS-PAGE nella direzione perpendicolare.

Elettroforesi Nativa vs Denaturante

Come scegliere fra un’elettroforesi denaturante e una nativa? Una elettroforesi nativa potrebbe dare risultati ingannevoli a causa della forma della molecola, perciò in genere si preferiscono quelle denaturanti. Tuttavia, consente di preservare l’attività biologica della proteina, di identificare la posizione della proteina nel gel mediante specifici saggi funzionali e di recuperarla in forma attiva, ed è indicata per evidenziare la contemporanea presenza di forme monomeriche e oligomeriche di una specie proteica pura.

Bisogna però considerare che non si può conoscere a priori la mobilità elettroforetica della proteina, né ne si possono identificare le dimensioni, quindi il risultato resta poco affidabile.

Elettroforesi degli Acidi Nucleici

L’elettroforesi degli acidi nucleici viene principalmente utilizzata per l’analisi di frammenti di DNA. Questa segue gli stessi principi elettrochimici dell’elettroforesi proteica anche se prevede metodiche leggermente differenti.

La prima differenza fra un’elettroforesi proteica e una svolta sugli acidi nucleici sta nel fatto che le molecole in questione nel secondo caso sono sempre cariche negativamente. Data la struttura di base di DNA e RNA, infatti, essendo i nucleotidi composti da una molecola di ribosio, una base azotata e un fosfato, le molecole sono necessariamente a carica fortemente negativa.

Inoltre, in questo tipo di elettroforesi varia la matrice: non si parla più di poliacrilamide ma di gel di agarosio, un polimero polisaccaride purificato dall’agar-agar, sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle alghe rosse. Altra differenza sta nella posizione della cella elettrolitica: se nel caso dell’elettroforesi proteica il gel di acrilamide viene posto verticalmente, nel caso si analizzino acidi nucleici il gel di agarosio si dispone orizzontalmente.

Nel caso di elettroforesi di DNA, inoltre, si utilizzano enzimi di restrizione e quindi proteine appartenenti alla classe delle idrolasi: si tratta di deossiribonucleasi II sito-specifiche. Questi enzimi sono capaci di frammentare il doppio filamento del DNA agendo in modo da tagliare entrambi i filamenti ad una stessa altezza. In questo modo il genoma viene degradato in sezioni di tutte le grandezze e può poi così essere analizzato in elettroforesi.

Per quanto riguarda la visualizzazione dello spettro elettroforetico finale, nel caso degli acidi nucleici non si utilizzano coloranti semplici come nel caso delle proteine, bensì composti che in genere risultano agenti intercalanti per il genoma stesso. Il più utilizzato è il bromuro di etidio. Questa molecola, completamente planare, possiede atomi tutti ibridizzati sp2 grazie ai doppi legami coniugati che li uniscono. Si presenta così di spessore paragonabile a quello delle basi azotate fra le quali può incunearsi (intercalare): una volta che il bromuro di etidio intercala, la fluorescenza della sezione di DNA se illuminato da raggi UV aumenta di circa 100 volte.

L’elettroforesi degli acidi nucleici utilizza una matrice diversa che si compone di gel di agarosio. L’elettroforesi su gel di agarosio è utile per analizzare la grandezza dei singoli frammenti di DNA e per andare a valutare la presenza di specifiche sequenze di DNA.

Per analizzare la dimensione dei frammenti si utilizza una soluzione, da inserire nel primo pozzetto, contenente frammenti DNA di dimensioni note. In questo modo confrontando il percorso svolto da questi frammenti con quelli presenti negli altri pozzetti si potranno osservare le effettive dimensioni degli stessi.
Per quanto riguarda la presenza di specifiche sequenze di DNA, invece, si utilizzano tecniche specifiche che sfruttano sonde a DNA marcate con sostanze radioattive. Il campione di DNA è denaturato quando è ancora immobilizzato nel gel e viene poi esposto a sonde specifiche marcate con elementi radioattivi: in questo modo le sonde si legheranno ai singoli filamenti ad esse complementari così che specifiche sequenze possano essere ritrovate nel gel.

Il risultato dell’elettroforesi di DNA viene osservato al transilluminatore.

Applicazioni Cliniche dell'Elettroforesi delle Proteine

L’elettroforesi delle proteine ha numerose applicazioni cliniche, essendo uno strumento diagnostico essenziale per molte patologie. Questa tecnica è utilizzata anche per identificare e monitorare le disfunzioni epatiche e renali, analizzando le proteine presenti nel siero e nelle urine.

Ogni banda rappresenta una proteina o un gruppo di proteine con caratteristiche simili, e la loro posizione e intensità forniscono informazioni sulla quantità e la natura delle proteine presenti nel campione. L’analisi quantitativa delle bande elettroforetiche è spesso effettuata con software specifici che misurano l’intensità delle bande e calcolano la concentrazione relativa delle proteine.

In chimica e in medicina, l’elettroforesi proteica è un metodo d’analisi per le proteine presenti nel sangue e nel siero. È, quindi, un metodo di separazione di particelle cariche elettricamente, che avviene attraverso elettroforesi, cioè tramite il passaggio continuo di corrente elettrica in una soluzione.

Nell’elettroforesi le proteine reagiscono come molecole elettricamente cariche in soluzione acida o alcalina. Le particelle cariche migrano verso l’elettrodo di carica opposta con una velocità di migrazione (o mobilità elettroforetica) legata a numerosi fattori dipendenti dalla natura del mezzo e dal campo elettrico applicato e soprattutto dalla massa, dalle dimensioni, dalla carica e dalla forma delle varie particelle.

Solitamente albumina e globuline sono in proporzioni simili, ma l’albumina è molto più corta e carica negativamente, mostrando una concentrazione visiva maggiore. E’ una proteina prodotta dal fegato ed ha diverse funzioni, tra cui la conservazione corretta dei liquidi nell’organismo, perché con la sua presenza fa in modo che i liquidi stiano all’interno dei vasi sanguigni e non debordino (sovrintende alla cosiddetta “pressione osmotica”). Inoltre, ha il compito di trasportare, attraverso il sangue, i principi attivi dei farmaci che vengono assunti, gli ormoni e le sostanze come la bilirubina.

Come si è detto, l’elettroforesi delle proteine consiste nella separazione delle proteine del siero: in seguito al prelievo di sangue venoso, in sostanza, il campione è sottoposto a centrifugazione che ha lo scopo di ottenere il plasma senza fibrinogeno, cioè il siero, il quale in seguito viene sottoposto a un campo elettrico in virtù del quale le proteine presenti possono essere suddivise in gruppi in funzione della loro massa. Ciò è possibile perché, nel momento in cui sono sottoposte a un campo elettrico, le proteine tendono a migrare in direzione del polo positivo con velocità differenti che cambiano a seconda della carica elettrica.

La tecnologia Sebia su gel si basa sul principio della separazione delle molecole all’interno di un gel d’agarosio. Gli strumenti HYDRASYS consentono l’analisi simultanea di diversi campioni (fino a162/ora). Applicazione del campione, migrazione, lavaggio e colorazione del gel vengono effettuati automaticamente. Per quantificare le frazioni proteiche, i gel processati possono essere scansionati con un densitometro, integrato nel modello HYDRASYS 2 Scan.

L'elettroforesi è una tecnica utilizzata nell'ambito delle analisi di laboratorio che sfrutta la massa molecolare e la carica elettrica delle proteine, per valutarne la quantità e la qualità. In particolare, quest'esame consente di separare le proteine in cinque frazioni: albumina, alfa 1 globuline, alfa 2 globuline, beta globuline e gamma globuline. L'alterazione del rapporto tra questi tipi di proteine è indicativa di alcune condizioni patologiche.

Chiamata anche elettroforesi proteica o protidogramma, quest'esame è realizzato adottando un metodo molto particolare: al campione è applicato un campo elettrico, grazie al quale le proteine si "raggruppano" per tipologia. Ciascuna delle proteine che permette di analizzare l'elettroforesi, infatti, ha una propria massa molecolare e una carica elettrica, che consente loro di rispondere alla sollecitazione, fornita dalla corrente continua, in un modo caratteristico.

L'elettroforesi è un'analisi di laboratorio che fornisce importanti informazioni circa la quantità di proteine presenti nel siero sanguigno o in altri campioni biologici e, per ogni frazione, rivela se siano presenti delle anomalie in termini di qualità. Il risultato dell'elettroforesi permette di esaminare la concentrazione di questi parametri: l'eventuale alterazione del rapporto tra questi gruppi di proteine si osserva durante alcuni stati patologici.

Le proteine plasmatiche sono indicatori molto importanti: eventuali alterazioni delle loro concentrazioni possono segnalare la presenza di numerose malattie. In laboratorio, l'elettroforesi è una delle tecniche più utilizzate per analizzare la composizione qualitativa e quantitativa delle proteine.

L'albumina è la più abbondante proteina nel siero, nonché una delle più importanti dell'organismo. Questa viene sintetizzata dal fegato ed è contenuta soprattutto nei liquidi interstiziali e nel plasma, dove rappresenta, da sola, circa la metà delle proteine circolanti.

Le globuline alfa 1 e 2 svolgono principalmente una funzione di trasporto dei lipidi, dei grassi del sangue e degli ormoni. Anche le beta globuline trasportano le sostanze presenti nel sangue; tra le più note proteine di questo gruppo vi sono la transferrina (deputata al trasporto del ferro) e la beta-2 microglobulina.

In generale, l'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche, attraverso una soluzione ed un mezzo di supporto poroso e inerte (come carta, gel di agarosio o foglio di acetato di cellulosa), sotto l'impulso di un campo elettrico.

Molte molecole di interesse biologico (aminoacidi, peptidi, proteine, DNA e RNA) possiedono gruppi ionizzabili nella loro struttura, quindi, ad un opportuno valore di pH, queste sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche. Quando sono poste in un ambiente basico, le proteine si comportano da acidi: il gruppo COOH dei vari amminoacidi che costituiscono la struttura della macromolecola, si dissocia in COO- (particella negativa) e H+ (ione positivo).

Tornando all'esame, il campione del paziente - contenente una miscela di proteine (es. PREMESSA: il dosaggio delle proteine totali nel sangue - proteinemia - e dell'albumina - albuminemia - è di norma inclusa nei pannelli di controllo, quindi è frequentemente usata nella valutazione dello stato di salute di una persona.

Quando nelle urine è presente un'alta concentrazione di proteine, invece, il medico può richiedere l'esecuzione dell'elettroforesi delle PROTEINE URINARIE. L'elettroforesi delle PROTEINE DEL LIQUOR può essere prescritta quando si sospetta la diagnosi di sclerosi multipla.

Normalmente, con l'elettroforesi è riscontrabile una piccola concentrazione di proteine nell'urina. In condizioni normali, la concentrazione delle proteine totali nel liquor è molto bassa.

Elettroforesi sieroproteica (esame del sangue): per ottenere il tracciato elettroforetico sul siero è necessario sottoporsi ad un semplice prelievo di sangue dalla vena di un braccio.
Elettroforesi delle proteine urinarie (analisi delle urine): è necessario raccogliere una piccola quantità di urine in un apposito contenitore sterile.

Prima del prelievo ematico, alcuni laboratori potrebbero richiedere di osservare un digiuno di almeno 10-12 ore. Alcuni medicinali possono influenzare l'esito dell'elettroforesi, pertanto è consigliabile segnalare al medico eventuali terapie in corso.

Bisogna sempre ricordare che i valori di riferimento possono cambiare da un laboratorio ad un altro.