Elettroforesi Capillare: Scopri i Segreti del Sequenziamento DNA e le Sue Incredibili Applicazioni

L'elettroforesi è una tecnica analitica fondamentale utilizzata per separare macromolecole cariche, consentendo la distinzione in base alle loro dimensioni o alla carica elettrica che le contraddistingue. Essa consente quindi la distinzione delle stesse in base alle loro dimensioni o alla carica elettrica che le contraddistingue.

Principi dell'Elettroforesi

L’elettroforesi è una tecnica analitica che consente la separazione in liquido di macromolecole cariche, poste in un campo elettrico, attraverso la migrazione differenziale delle stesse in matrice di agarosio o poliacrilamide. Questa tecnica consente quindi la separazione di proteine e acidi nucleici in base alle dimensioni e/o cariche delle molecole in questione.

Il principio chimico-fisico su cui si basa l’elettroforesi consiste nella risposta che molecole cariche producono se immerse in un campo elettrico: queste, infatti, tenderanno a muoversi lungo le linee del campo di modo che gli ioni positivi migrino verso il polo negativo e quelli negativi verso il polo positivo.

La mobilità delle molecole varia in base alle dimensioni, alle cariche elettriche e alle forme delle molecole, alla differenza di potenziale associata al campo elettrico applicato e alla natura del materiale di cui è composto il gel.

La mobilità elettroforetica (Ue) può essere descritta dalla formula:

Ue = (εζf(ka)) / η

dove ε è la costante dielettrica, ζ il potenziale zeta, f(ka) la funzione di Henry e η la viscosità del solvente.

Mentre la costante dielettrica quantifica la tendenza del materiale a contrastare l’intensità del campo elettrico applicato, il potenziale zeta prende in considerazione le due fasi differenti all’interno della cella elettrolitica: quella liquida nella quale sono presenti le molecole da analizzare e quella solida costituita dai due elettrodi che vengono raggiunti dalle diverse molecole durante la corsa elettroforetica. Il potenziale zeta, infatti, è la tensione che si genera dalla formazione di un doppio strato elettrico e quindi di un’interfaccia solido-liquido in corrispondenza della quale si instaura un trasferimento di carica.

Elettroforesi delle Proteine

L’elettroforesi delle proteine è la tecnica più ampiamente utilizzata in tutti i laboratori di biochimica. Essa è utile per lo studio di soluzioni delle quali si vuole analizzare il contenuto proteico: l’osservazione della migrazione delle diverse molecole, infatti, fornisce uno spettro finale che rispecchia le caratteristiche delle proteine presenti in soluzione. La caratteristica principale per cui si distingue l’elettroforesi proteica da quella volta all’analisi del DNA sta nella matrice: quella più usata per lo studio dei polipeptidi è la poliacrilamide, da cui deriva il nome PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis, con cui si indica il processo di elettroforesi proteica.

Vengono impaccati due gel con distinte porosità, ottenuti facendo co-polimerizzare acrilamide con metilenbisacrilamide. Il gel di impaccamento, o stacking gel, serve a favorire la concentrazione del campione in una zona molto stretta del gel per migliorare la risoluzione delle bande, prima di entrare nel gel di corsa. Il gel di corsa, o running gel, è necessario per ottenere la separazione delle proteine.

Per visualizzare la traccia elettroforetica, infine, si può utilizzare il colorante Coomassie brilliant blue R-250 oppure la tecnica del silver staining. Nel primo caso il gel viene immerso nella soluzione colorante così che si formino interazioni ioniche tra i gruppi solfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine, oltre a interazioni di Van der Waals. L’eccesso di colorante viene eliminato immergendo il gel in una soluzione di etanolo e acido acetico. Nel secondo caso le proteine sono trattate in modo da diventare sensibili all’argento e poi con un sale dello stesso metallo (in genere nitrato). Una soluzione di sviluppo contenente formaldeide fa precipitare l’argento legato alle proteine riducendo i cationi ad argento metallico. La riduzione viene poi fermata con EDTA.

Esistono vari tipi di elettroforesi di proteine. E’ possibile separare le proteine in condizioni native sulla base delle dimensioni e della carica (elettroforesi nativa), per punto isoelettrico (isoelettroforesi), oppure solamente in base alle loro dimensioni (SDS-PAGE). In ogni caso bisogna considerare che la velocità di migrazione sarà sempre direttamente proporzionale al campo elettrico applicato e alla carica della molecola, mentre risulterà inversamente proporzionale alla viscosità del mezzo e alle dimensioni della molecola (massa molecolare e forma).

Altro tipo di elettroforesi proteica è quella capillare: sono utilizzati tubi sottili e stretti di diametro interno compreso fra i 20 e i 100 micron, di modo che il calore possa essere velocemente dissipato per poter usare campi elettrici molto alti con la contemporanea riduzione dei tempi di separazione ad alcuni minuti.

SDS-PAGE

L’elettroforesi SDS-PAGE consiste in un tipo di corsa elettroforetica in cui le molecole proteiche vengono distinte esclusivamente in base alla loro massa. Il nome di questo tipo di tecnica ci indica il suo principale componente: il sodio dodecil-solfato (SDS). L’SDS è un tensioattivo che in presenza di proteine ne rompe i legami non-covalenti denaturandole e quindi privandole della loro forma originaria. Al campione viene aggiunto, inoltre, beta-mercapto-etanolo, che agisce da secondo denaturante rompendo i ponti disolfuro della proteina, e somministrato calore. L’estremità anionica della molecola di SDS lega i residui amminoacidici della proteina impartendo ad essa una notevole carica negativa. In questo modo alle proteine denaturate si impartisce una carica che possa uniformarle tutte.

Sappiamo che, dati specifici valori di campo elettrico e di viscosità del mezzo, a parità di carica, migrerà più velocemente la molecola di raggio minore: per questo spesso viene scelta la SDS-PAGE, poiché permette di confrontare le proteine esclusivamente per quella che è la loro massa.

Una volta terminato il processo di elettroforesi il gel di poliacrilamide viene posto all’interno di una soluzione di colorante, in questo caso di Coomassie brilliant blue R-250.

Isoelettroforesi (IEF)

L’isoelettroforesi, o isoelettrofocalizzazione (IEF), oppure ancora focalizzazione isoelettrica, sfrutta il punto isoelettrico caratteristico di ciascuna proteina per distinguere le molecole nella loro corsa sulla matrice di gel. Il punto isoelettrico di una molecola corrisponde a quel valore di pH per cui, se in elettroforesi, la molecola smette di migrare e si ferma. Considerando che una proteina, essendo costituita da amminoacidi, e quindi da potenziali zwitterioni, possiede entrambe le polarità, ciascun polipeptide ha un suo proprio punto isoelettrico (pI) in corrispondenza del quale si ferma in elettroforesi.

Se si sottopone una miscela di proteine a elettroforesi attraverso una soluzione o un gel con un gradiente stabile di pH, in cui il pH aumenta in modo regolare dall’anodo al catodo, ciascuna proteina migrerà fino alla posizione corrispondente al suo pI. Il campione è prima sottoposto a IEF in una direzione, quindi le molecole proteiche vengono distinte mediante SDS-PAGE nella direzione perpendicolare.

Elettroforesi Nativa vs. Denaturante

Come scegliere fra un’elettroforesi denaturante e una nativa? Una elettroforesi nativa potrebbe dare risultati ingannevoli a causa della forma della molecola, perciò in genere si preferiscono quelle denaturanti. Tuttavia, consente di preservare l’attività biologica della proteina, di identificare la posizione della proteina nel gel mediante specifici saggi funzionali e di recuperarla in forma attiva, ed è indicata per evidenziare la contemporanea presenza di forme monomeriche e oligomeriche di una specie proteica pura.

Bisogna però considerare che non si può conoscere a priori la mobilità elettroforetica della proteina, né ne si possono identificare le dimensioni, quindi il risultato resta poco affidabile.

Elettroforesi degli Acidi Nucleici

L’elettroforesi degli acidi nucleici viene principalmente utilizzata per l’analisi di frammenti di DNA. Questa segue gli stessi principi elettrochimici dell’elettroforesi proteica anche se prevede metodiche leggermente differenti. La prima differenza fra un’elettroforesi proteica e una svolta sugli acidi nucleici sta nel fatto che le molecole in questione nel secondo caso sono sempre cariche negativamente. Data la struttura di base di DNA e RNA, infatti, essendo i nucleotidi composti da una molecola di ribosio, una base azotata e un fosfato, le molecole sono necessariamente a carica fortemente negativa.

Inoltre, in questo tipo di elettroforesi varia la matrice: non si parla più di poliacrilamide ma di gel di agarosio, un polimero polisaccaride purificato dall’agar-agar, sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle alghe rosse. Altra differenza sta nella posizione della cella elettrolitica: se nel caso dell’elettroforesi proteica il gel di acrilamide viene posto verticalmente, nel caso si analizzino acidi nucleici il gel di agarosio si dispone orizzontalmente.

Nel caso di elettroforesi di DNA, inoltre, si utilizzano enzimi di restrizione e quindi proteine appartenenti alla classe delle idrolasi: si tratta di deossiribonucleasi II sito-specifiche. Questi enzimi sono capaci di frammentare il doppio filamento del DNA agendo in modo da tagliare entrambi i filamenti ad una stessa altezza. In questo modo il genoma viene degradato in sezioni di tutte le grandezze e può poi così essere analizzato in elettroforesi.

Per quanto riguarda la visualizzazione dello spettro elettroforetico finale, nel caso degli acidi nucleici non si utilizzano coloranti semplici come nel caso delle proteine, bensì composti che in genere risultano agenti intercalanti per il genoma stesso. Il più utilizzato è il bromuro di etidio. Questa molecola, completamente planare, possiede atomi tutti ibridizzati sp2 grazie ai doppi legami coniugati che li uniscono. Si presenta così di spessore paragonabile a quello delle basi azotate fra le quali può incunearsi (intercalare): una volta che il bromuro di etidio intercala, la fluorescenza della sezione di DNA se illuminato da raggi UV aumenta di circa 100 volte.

Elettroforesi su Gel di Agarosio

L’elettroforesi degli acidi nucleici utilizza una matrice diversa che si compone di gel di agarosio. L’elettroforesi su gel di agarosio è utile per analizzare la grandezza dei singoli frammenti di DNA e per andare a valutare la presenza di specifiche sequenze di DNA. Per analizzare la dimensione dei frammenti si utilizza una soluzione, da inserire nel primo pozzetto, contenente frammenti DNA di dimensioni note. In questo modo confrontando il percorso svolto da questi frammenti con quelli presenti negli altri pozzetti si potranno osservare le effettive dimensioni degli stessi.

Per quanto riguarda la presenza di specifiche sequenze di DNA, invece, si utilizzano tecniche specifiche che sfruttano sonde a DNA marcate con sostanze radioattive. Il campione di DNA è denaturato quando è ancora immobilizzato nel gel e viene poi esposto a sonde specifiche marcate con elementi radioattivi: in questo modo le sonde si legheranno ai singoli filamenti ad esse complementari così che specifiche sequenze possano essere ritrovate nel gel.

Il risultato dell’elettroforesi di DNA viene osservato al transilluminatore.

Sequenziamento del DNA: Principi e Applicazioni

Sequenziare il DNA significa determinare l’ordine dei nucleotidi, le unità che lo compongono. Con sequenziamento del DNA si intende in effetti il processo con il quale si può stabilire l’ordine dei nucleotidi che compongono una molecola di DNA.

I nucleotidi sono gli elementi che costituiscono gli acidi nucleici (il DNA o l’RNA) e sono formati da 3 porzioni: due non variano e sono sempre uno zucchero (il deossiribosio nel DNA e il ribosio nell’RNA) e un gruppo fosfato, mentre la terza, una base azotata, può essere di 4 tipi diversi. Le basi azotate del DNA sono l’adenina (A), la citosina (C), la guanina (G) e la timina (T). Quest’ultima è sostituita dall’uracile (U) nell’RNA.

Il DNA è fatto di due filamenti avvolti tra loro, i cui legami si formano proprio tra le basi azotate, e in particolare tra A e T e tra C e G. Anche per questo si parla di complementarità delle basi. Sequenziando un segmento di DNA arriviamo quindi a conoscere l’ordine delle sue basi.

Applicazioni del Sequenziamento del DNA

Oggi il sequenziamento del DNA è una tecnica comune, utilizzata in molti ambiti, tra cui:

nella ricerca, per esempio per studiare lo sviluppo e l’evoluzione delle specie;
nei test prenatali, per rilevare possibili mutazioni ereditarie che possono far aumentare il rischio di determinate malattie anche tumorali;
per caratterizzare gli agenti patogeni e trarre informazioni utili contro epidemie e pandemie, come accaduto di recente per il virus SARS-CoV-2 responsabile della malattia COVID-19;
nell’ambito del cancro, il sequenziamento del DNA può essere utilizzato con diversi scopi, sia clinici sia di ricerca, per la diagnosi e il monitoraggio della malattia e per lo sviluppo di terapie mirate.

Un po’ di storia del sequenziamento del DNA

I primi tentativi di sequenziare il DNA risalgono alla seconda metà del Novecento. La prima sequenza pubblicata, lunga 24 basi, è del 1973, a opera degli scienziati statunitensi Allan Maxam e Walter Gilbert alla Harvard University a Cambridge, Massachusetts. Raggiungere questo obiettivo aveva richiesto ben due anni.

Nella seconda metà degli anni Settanta furono sviluppati due metodi di sequenziamento, uno a cura di Maxam e Gilbert e uno più veloce ed efficace, ideato dal chimico britannico Frederick Sanger all’Università di Cambridge. Per i loro contributi, Gilbert e Sanger hanno ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 1980.

Da notare che per Sanger era il secondo Nobel per la chimica: il primo gli era stato conferito nel 1958 per aver determinato per la prima volta la struttura e la sequenza completa di amminoacidi di una proteina, l’insulina.

Il Metodo di Sanger

Il metodo di sequenziamento di Sanger, ancora oggi utilizzato in determinate circostanze, si basa sulla sintesi da parte dell’enzima DNA polimerasi di catene di DNA di varia lunghezza e sull’uso di dideossinucleotidi trifosfato (ddNTP). Si tratta di nucleotidi quasi uguali a quelli presenti normalmente nel DNA, ma a cui manca una parte (il gruppo ossidrile sullo zucchero) che è fondamentale perché possano legarsi con un nucleotide successivo. In pratica, ciò che avviene nelle provette usate per il sequenziamento è la sintesi di filamenti complementari al frammento di DNA che si desidera sequenziare.

Semplificando, gli ingredienti necessari sono il segmento di DNA, la DNA polimerasi (un enzima necessario a “montare” i pezzi del DNA), un breve e particolare segmento di DNA marcato radioattivamente, i 4 normali deossinucleotidi trifosfato, più un tipo di ddNTP. La DNA polimerasi sintetizza il nuovo filamento inserendo i normali deossinucleotidi trifosfato in base a quelli presenti sul segmento di DNA di partenza. La sintesi, però, si arresta quando la DNA polimerasi incorpora un ddNTP. Quindi, dopo molte reazioni si otterrà una miscela di frammenti di diversa lunghezza che terminano tutti con quel particolare ddNTP. Con questo metodo sono dunque necessarie 4 reazioni, una per ogni nucleotide, per stabilire tutte le posizioni dei 4 elementi costituenti all’interno del DNA.

I frammenti ottenuti, tutti di lunghezze differenti, vengono poi separati in base alla loro dimensione mediante una tecnica chiamata elettroforesi su gel. In seguito, grazie all’uso di una particolare pellicola, è possibile visualizzare la posizione dei frammenti e leggere la sequenza del filamento.

Il metodo di Sanger è stato poi ottimizzato e automatizzato, con l’uso di macchine che includono, oltre ai sequenziatori, anche sistemi di elettroforesi capillare (dove il gel è contenuto appunto in un capillare). Inoltre, i 4 ddNTP in questa versione non sono marcati radioattivamente, bensì con un colorante fluorescente. Grazie a questa tecnica, che necessita di una sola reazione invece di 4, il sequenziamento è diventato più veloce e meno costoso.

Il Progetto Genoma Umano

Il Progetto Genoma Umano, iniziato nel 1990, ha portato a una prima bozza della sequenza dei geni della nostra specie nel 2001 e al suo quasi totale completamento nel 2003. Questa grande ricerca internazionale non si sarebbe potuta concludere tanto velocemente senza la collaborazione di numerosi scienziati in molti Paesi del mondo. La prima bozza copriva circa il 90 per cento del genoma, mentre quella finale arrivava al 99 per cento circa ed era caratterizzata da un tasso di errori inferiore. Nella seconda versione furono tra l’altro colmati la maggior parte dei vuoti (o gap) rimasti tra i vari frammenti delle sequenze.

Inizialmente il progetto era talmente ambizioso che in pochi credevano che nel tempo previsto potessero essere letti tutti i circa 3 miliardi di nucleotidi di cui è composto il nostro genoma. Contro ogni aspettativa, il Progetto Genoma Umano si è invece concluso addirittura in anticipo ed è stato una pietra miliare, oltre che un grande successo di pubblico: l’annuncio dell’imminente completamento della prima bozza fu dato, nel 2000, dal presidente statunitense Bill Clinton e dal primo ministro britannico Tony Blair, in presenza degli scienziati Francis Collins e John Craig Venter, che avevano coordinato i due “bracci”, rispettivamente pubblici e privati, dell’impresa.

Alle sequenze completate nel 2003 si sono di recente aggiunti dettagli molto importanti, pubblicati ad aprile 2022. Ci sono infatti voluti ulteriori 19 anni per completare una piccola percentuale (circa l’8 per cento) di DNA che con le tecniche precedenti non era del tutto accessibile o leggibile. I risultati, annunciati sulla rivista Science, riportano per esempio le sequenze di parti di DNA difficili altamente ripetitivi, dove sono peraltro contenuti almeno 1.900 geni. Non solo: questa recente lettura ha permesso di ottenere campioni di genoma umano da popolazioni più vaste ed eterogenee di quelle coinvolte a cavallo del secolo, rendendo queste ultime sequenze più rappresentative della diversità genetica di tutta l’umanità.

Fasi del Sequenziamento del DNA

Per stabilire la sequenza di nucleotidi di una molecola di DNA, o dell’intero genoma di un organismo, si usano essenzialmente variazioni sugli stessi principi tecnologici, con importanti differenze.

È innanzitutto necessario spezzettare le molecole di DNA in una serie di frammenti, che nell’insieme formano quella che viene chiamata libreria. Dopo questo passaggio si va a determinare la sequenza dei diversi frammenti passando di solito attraverso un processo di amplificazione di ciascun frammento tramite PCR, ottenendo così quantità di DNA adeguato a procedere con il sequenziamento.

Una volta ottenuta la sequenza di ciascun frammento, il lavoro non è finito: occorre capire come sono disposti tra loro i diversi pezzi letti, tramite appositi programmi informatici che aiutano a ricostruire la sequenza completa. Questo passaggio può essere difficoltoso a causa della complessità del genoma.

Si possono poi identificare gli elementi funzionali, nel processo noto come annotazione. Il genoma è, in effetti, una sorta di libro nel quale è contenuta tutta l’informazione genetica di un organismo. Quindi, ottenere la sua sequenza non significa capirne il contenuto: vuole solo dire che abbiamo compreso di quali lettere è composto e in quale ordine.

Per l’analisi e l’interpretazione delle informazioni ci si affida a strumenti di bioinformatica. Le innovazioni in questa disciplina sono fondamentali per il progresso dei sequenziamenti del DNA, perché i milioni di dati ottenuti devono essere non solo letti e interpretati, ma anche catalogati e conservati affinché possano essere consultati e studiati.

Un altro aspetto da non dimenticare quando si parla di sequenze di DNA sono, infatti, le cosiddette banche dati genetiche. Si tratta di grandi archivi informatici nei quali le sequenze vengono raccolte, catalogate e messe a disposizione degli scienziati di tutto il mondo per le proprie analisi. Tali analisi possono per esempio includere confronti tra sequenze nuove, cioè appena ottenute, e altre già presenti in archivio, che fungono da riferimento.

Tecniche di Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS)

I metodi di sequenziamento sviluppati inizialmente da Sanger sono stati affiancati e in parte superati dalle cosiddette tecniche di nuova generazione, o Next Generation Sequencing (NGS). Con questa tecnologia tutte le reazioni necessarie a un sequenziamento avvengono in una singola provetta, peraltro a partire anche da piccole quantità di DNA e in un piccolo volume di soluzione. Semplificando al massimo, dopo la creazione della libreria di frammenti di DNA dal campione di partenza, i frammenti vengono automaticamente fissati su appositi supporti contenenti delle specifiche sequenze.

Queste sono complementari ad almeno una parte dei frammenti del campione. Dopodiché, questi frammenti vengono amplificati e, infine, sequenziati. Poiché le macchine di NGS possono processare moltissime provette in parallelo, è possibile ottenere il sequenziamento di migliaia di frammenti di DNA allo stesso tempo.

Ancora più recenti sono le tecnologie di terza generazione, che offrono diversi vantaggi: uno tra tutti, la possibilità di leggere frammenti anche molto lunghi senza che sia necessario frammentarli né amplificarli.

La scelta tra le diverse tecnologie può dipendere da vari fattori, tra cui lo scopo della ricerca ‒ per esempio se si desidera sequenziare un nuovo genoma oppure se si intende studiare più in dettaglio una specifica regione di un genoma già conosciuto, o ancora cercare una particolare mutazione in un campione di DNA.

Qualunque sia la tecnica scelta, le sequenze ottenute sono lette, ordinate e interpretate grazie agli strumenti bioinformatici di cui si parlava sopra.