Riportiamo il caso di una donna diabetica proveniente dall'Africa occidentale con una presunta diagnosi di HbSS precedentemente suggerita in un altro laboratorio. Tuttavia, durante l'analisi per HbA1c con un nuovo strumento per elettroforesi capillare in grado di analizzare sia HbA1c che varianti emoglobiniche, abbiamo sospettato e successivamente confermato (con uno studio molecolare centralizzato) la presenza di una doppia eterozigosi per un difetto del gene beta, vale a dire HbS e persistenza ereditaria dell'emoglobina fetale (HbS/HPFH).
Caso Clinico
Una paziente diabetica di 62 anni, originaria dell’Africa occidentale e non nota presso il nostro laboratorio, giungeva alla nostra attenzione per la richiesta di misurazione di emoglobina glicata (HbA1c) per la valutazione del controllo glicemico.
L’esame veniva eseguito su campione di sangue intero raccolto in provetta con K2EDTA, mediante tecnica separativa basata su cromatografia liquida a scambio ionico (HPLC D-100, BioRad, Hercules, CA, USA): lo strumento forniva un risultato di 62 mmol/mol (i.r. 20-38; obiettivo terapeutico per adulto diabetico <53) ma mostrava un valore particolarmente elevato di HbF, pari al 29,9% (v.r. per l’adulto <1), evidenziando al contempo la presenza di picchi aggiuntivi e non risolti delle varie forme di emoglobina e segnalando con un allarme analitico la presenza di una possibile variante emoglobinica.
In assenza di risultati precedenti della stessa paziente disponibili presso il nostro laboratorio, veniva eseguita una ricerca di informazioni cliniche mediante consultazione dell’archivio del sistema informatico di Laboratorio (LIS).
Dall’archivio del LIS risultava inoltre un valore di HbA1c refertato in occasione di un precedente controllo presso un laboratorio periferico impiegante la nostra stessa tecnologia analitica in HPLC, nonostante un assetto emoglobinico già studiato in un terzo Laboratorio, ove si concludeva per un quadro di drepanocitosi omozigote (HbSS). Sulla base delle informazioni clinico-laboratoristiche ottenute e del tracciato cromatografico risultato in sede di analisi per HbA1c, la diagnosi di drepanocitosi omozigote veniva però messa in dubbio a causa dell’elevato valore di HbF segnalato dallo strumento.
Il campione per la misurazione di HbA1c veniva quindi analizzato con diverso strumento e con diversa tecnologia analitica basata su elettroforesi capillare (Capillarys 3 Tera con kit Capi3-HbA1c, Sebia, Lisses, France).
L’elettroferogramma ad alta risoluzione riportava in questo caso i seguenti risultati: HbF o Hb variante 39,8%, HbS 54,8%, HbA2 2,0% HbS1c 3,4%. Il tracciato mostrava inoltre chiaramente l’assenza di HbA0 (non riportando quindi un valore di HbA1c) e il profilo veniva classificato dal software dello strumento come “atipico”.
Il campione veniva rianalizzato sullo stesso strumento con modalità analitica per varianti emoglobiniche (Capillarys 3 Tera con Hemoglobine kit, Sebia, Lisses France), con i seguenti risultati: HbF 38,6%, HbS 59,2% e HbA2 2,2%
Nel sospetto di una doppia eterozigosi per mutazione a carico del gene beta globinico, il campione veniva successivamente inviato per approfondimento diagnostico ad un laboratorio di secondo livello per l’analisi molecolare, dove veniva confermata un’eterozigosi composta con HbS [NM_000518.4(HBB): c.20A>T]e persistenza ereditaria di HbF dovuta a delezione di tipo 2 del cluster genico beta globinico (NG_000007.3: g.54867_139178del84312; HPFH-2 Ghanaian).
In conclusione, il valore di HbA1c non veniva riportato in referto ma era consigliato, mediante commento interpretativo, un biomarcatore alternativo (albumina glicata) per la valutazione del controllo glicemico della paziente.
Discussione
L’HbA1c rappresenta un biomarcatore di controllo glicemico a lungo termine fondamentale per la diagnosi e il monitoraggio del diabete mellito, patologia che in Italia ha una prevalenza stimata del 5,9% (oltre 3,5 milioni di individui), con una tendenza all’ aumento negli ultimi anni.
Rappresentando il prodotto di glicosilazione non enzimatica (glicazione) tra glucosio e valine N-terminali della catena β globinica dell’emoglobina A0, la misurazione dell’HbA1c è soggetta a interferenze causate dalla presenza di eventuali varianti emoglobiniche, in modo metodo- e variante- dipendente.
In particolare, vista la rilevanza epidemiologica del diabete mellito, è possibile il riscontro occasionale di una variante emoglobinica precedentemente sconosciuta o misconosciuta in occasione della misurazione dell’HbA1c, evenienza resa ancora più probabile dai flussi migratori attuali. Il caso clinico riportato descrive un riscontro emblematico in corso di misurazione dell’emoglobina glicata.
La rilevanza epidemiologica dell’effetto delle varianti emoglobiniche sulla misurazione dell’HbA1c è in effetti ben evidenziata anche dalla casistica osservata nella nostra popolazione.
Nella provincia di Modena, nel corso dell’anno 2022 sono state refertate 124120 HbA1c a fronte di una popolazione residente di poco superiore ai 700000 abitanti. In 218 di queste è stata segnalata una possibile variante non interferente con la corretta quantificazione della HbA1c e sulla base dei dati presenti su LIS, tale variante non era nota in 43 di questi casi.
In 6 casi invece si è riscontrata la presenza di una variante interferente con la quantificazione di HbA1c, ed è stato quindi consigliato mediante commento interpretativo un biomarcatore alternativo (albumina glicata) per la valutazione del controllo glicemico.
Il caso descritto riporta una rara forma di doppia eterozigosi per HbS e HPFH. Gli individui affetti da questa mutazione genetica generalmente non presentano complicanze associate alla falcizzazione delle emazie, che è infatti inibita dalla presenza di livelli aumentati di HbF, né mostrano alterazioni significative dell’esame emocromocitometrico.
La rilevanza del disordine per il nostro caso è invece dovuta all’interferenza della doppia eterozigosi delle catene globiniche con la misurazione dei livelli di HbA1c per il monitoraggio del diabete mellito: in casi come questo la misura dell’emoglobina glicata non deve essere effettuata.
In caso di variante emoglobinica nota, segnalata all’analisi della HbA1c, il laboratorio dovrebbe prima di tutto verificarne l’eventuale effetto sulla misurazione dell’emoglobina glicata con il metodo in uso, refertandone la concentrazione solo in caso di assenza di interferenza.
In caso invece la variante non fosse nota, il laboratorio può consigliare ulteriori esami a completamento diagnostico o, in caso sia dotato delle competenze necessarie, procedere con l’approfondimento separativo autonomamente o affidandosi a Centri di riferimento per tecniche analitiche di secondo livello (biologia molecolare).
I diversi metodi separativi disponibili in commercio per la valutazione degli assetti emoglobinici consentono di identificare la maggior parte delle varianti con alcune differenze dovute al diverso principio chimico-fisico utilizzato. Di conseguenza, la valutazione attenta di un tracciato e la combinazione di differenti tecniche (per esempio HPLC e elettroforesi capillare) possono dimostrarsi estremamente utili nell’aumentare il riscontro, anche occasionale, di nuove varianti emoglobiniche che, anche se non clinicamente rilevanti, possono dare luogo a fenotipi ematologici importanti se abbinati ad altri difetti delle catene beta e alfa.
In particolare, esso evidenzia l’importanza del ruolo del Laboratorio nel loro riconoscimento e nell’interpretazione della possibile interferenza sulla quantificazione dell’HbA1c.
In questo contesto, uno strumento in grado di eseguire una metodica separativa di approfondimento in caso di risultato HbA1c sospetto per la presenza di varianti emoglobiniche non note avrebbe rilevanza analitica e clinica, permettendo di ridurre il rischio derivabile da una scorretta informazione clinica rivolta al paziente affetto da diabete mellito.
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