Colorimetria nell'Analisi del Sangue: Scopri Come Questa Tecnica Rivoluziona la Diagnosi Medica!

La colorimetria, in termini semplici, è la misurazione del colore. Più precisamente, si tratta della determinazione della concentrazione di una sostanza attraverso la misurazione dell'assorbimento della luce relativa a quella sostanza. In colorimetria, una luce bianca, naturale o artificiale, è utilizzata come sorgente del sistema ottico, e le analisi vengono effettuate con uno strumento chiamato colorimetro o fotometro.

Cos'è la Fotometria?

La fotometria, in chimica strumentale, è l'insieme delle tecniche per la misurazione dell'intensità luminosa. Essa si basa sull'assorbimento della radiazione da parte del campione in esame (fotometria di assorbimento) oppure sull'emissione di luce da parte del campione opportunamente eccitato (fotometria di emissione).

La Relazione tra Luce e Colore

Per parlare di fotometria e per capire come si misura l'intensità della luce, bisogna dapprima capire la relazione tra colore e luce. I colori dipendono dalla luce e quello che noi vediamo come colore deriva dall’effetto della luce su un oggetto. Quando un fascio di luce bianca colpisce un oggetto, questo può essere riflesso, assorbito o trasmesso. Il vetro trasmette gran parte della luce con cui entra in contatto, perciò appare incolore. Un esempio è la neve che riflette tutta la luce e per questo appare bianca. Al contrario di un vestito nero che assorbe tutta la luce e quindi appare nero.

La maggior parte degli oggetti appare colorata perché la loro struttura chimica assorbe alcune lunghezze d’onda di luce e ne riflette altre. Per questo quando parliamo di luce, di solito ci riferiamo alla luce bianca. Una linea sottile di luce è chiamata raggio; un fascio invece è costituito da molti raggi di luce. Quando la luce bianca passa attraverso un prisma (un oggetto triangolare trasparente) i colori che compongono la luce bianca si disperdono in sette bande di colore (fasci di luce), che formano lo spettro. Sette colori costituiscono la luce bianca: rosso, arancione, giallo, verde, blu, indaco e viola. In qualsiasi spettro, i fasci di colore sono sempre organizzati in questo ordine da sinistra verso destra.

Le sostanze hanno la capacità intrinseca di assorbire la luce con un particolare colore. Supponendo di orientare un fascio di luce bianca verso una sostanza che assorbe la luce blu si verificherà una trasmissione di luce di colore giallo, il colore complementare del blu. Questa luce gialla raggiunge i nostri occhi e di conseguenza vediamo la sostanza colorata di giallo.

L’analisi colorimetrica si basa sulla variazione di colore che avviene nel campione in analisi. Questo cambiamento di colore è direttamente legato alla concentrazione della sostanza da ricercare.

Principi Fondamentali della Colorimetria

Un’analisi colorimetrica si basa sul principio che molte sostanze, reagendo con un composto chimico, producono un cambiamento di colore che sarà proporzionale alla concentrazione della sostanza da misurare. Quando una sostanza è esposta ad un fascio di luce di intensità (I₀), una parte della radiazione è assorbita dalla sostanza, emettendo una radiazione di intensità (I). La differenza di intensità è utilizzata per la determinazione colorimetrica.

La quantità di radiazione assorbita è data dalla legge di Lambert-Beer:

A = log (I₀/I)

L’assorbanza è data anche da:

A = ελ * C * l

Dove:

A è l'assorbanza (adimensionale)
ελ è il coefficiente di estinzione molare [L/(mol*cm)]
C è la concentrazione della sostanza (moli/litro)
l è il cammino ottico (cm)

Conoscendo i fattori noti, la concentrazione (C) può essere calcolata a partire dall’assorbanza della sostanza in relazione alla radiazione emessa (I).

Sistema Ottico per Analisi Fotometriche

I fotometri utilizzano un sistema ottico per misurare l'assorbanza. Un tipico schema di sistema ottico fotometrico comprende:

Sorgente luminosa: Generalmente un LED o una lampada a tungsteno. I LED offrono maggiore efficienza, minor consumo energetico e lunga durata.
Filtri di interferenza a banda stretta: Filtrano la luce in modo selettivo, garantendo accuratezza nella lunghezza d'onda.
Rilevatore di riferimento: Compensa le fluttuazioni della sorgente luminosa.
Cammino ottico: Utilizza cuvette in vetro per aumentare la precisione, specialmente a basse concentrazioni.
Lente di messa a fuoco: Raccoglie tutta la luce che fuoriesce dalla cuvetta e la focalizza sul fotorilevatore.

Fonti di Luce Utilizzate

Lampada al tungsteno: Lampada incandescente con filamento in tungsteno.
LED (Diodo ad Emissione di Luce): Offre maggiore efficienza e durata rispetto alle lampade al tungsteno.

Il cammino ottico è misurato mediante la grandezza della cuvetta contenente il campione. La cella fotometrica raccoglie la radiazione (I) emessa dal campione e la converte in corrente elettrica, producendo un potenziale in mV. Il microprocessore utilizza questo potenziale per convertire il valore in uscita in concentrazione, nell’unità di misura desiderata e lo visualizza sul display. Il campione da analizzare viene trattato seguendo una procedura ben definita e un software pre-programmato all’interno dello strumento assicura l’utilizzo di una curva di calibrazione relativa al metodo. Questa curva è utilizzata come riferimento per ogni misurazione.

Esempio di Reazione Chimica Colorimetrica: Metodo Nessler per l'Ammoniaca

Un esempio di analisi colorimetrica è il metodo Nessler per l’ammoniaca, proposto per la prima volta nel 1856. Nessler ha scoperto che aggiungendo una soluzione alcalina di Hgl₂ e Kl ad una soluzione diluita di ammoniaca si produce una colorazione marrone/gialla con intensità di colore proporzionale alla concentrazione di ammoniaca presente nel campione in analisi. Una quantità di campione o di soluzione standard è stata trasferita in una fiala (cuvetta) in vetro (con fondo piano). Le cuvette sono state poi posizionate in una griglia dotata di una superficie riflettente sul fondo che permette alla luce di passare attraverso la soluzione e la cuvetta. I colori dei campioni sono stati confrontati con quelli delle soluzioni standard per determinare la concentrazione del campione non noto.

Esempi di Analisi del Sangue e Colorimetria

La colorimetria trova applicazione in diverse analisi del sangue, tra cui:

Emocromo completo: Permette di monitorare lo stato di salute del paziente.
Determinazione del magnesio: Il deficit o l'aumento di magnesio possono essere indicativi di diverse condizioni mediche.

Provette per Prelievo di Sangue

È fondamentale osservare attentamente le provette utilizzate per il prelievo di sangue, in quanto a parità di colore del tappo non coincidono necessariamente gli additivi e le loro concentrazioni. Di seguito una panoramica delle provette più comuni:

Colore del Tappo	Anticoagulante/Additivo	Utilizzo
Rosso/Giallo	Nessuno	Esami sierologici (enzimi epatici, ormoni tiroidei, titolo anticorpale)
Viola	EDTA (acido etilendiaminotetracetico)	Esame emocromocitometrico
Azzurro	Sodio Citrato	VES, studio dei fattori di coagulazione, funzionalità piastrinica
Grigio	Fluoruro di Sodio	Stabilizzazione della concentrazione di glucosio
Verde	Eparina	Inibizione della formazione di trombina e fibrina

Le provette di coagulazione contengono una soluzione tamponata di trisodio citrato. Le provette sono disponibili con concentrazioni di sodio citrato di 0.109 mol/l (3.2%) o di 0.129 mol/l (3.8%). La scelta della concentrazione dipende dalle politiche dei laboratori. Le provette per siero hanno adeso all’interno micro particelle di silice che attivano la coagulazione quando le provette vengono invertite delicatamente dopo il prelievo. Le provette per siero con separatore integrato contengono un gel che è presente nella parte inferiore della provetta. Durante la centrifugazione il gel si muove verso l’alto formando una barriera stabile che separa il siero dalle cellule. Le provetta per plasma hanno adeso all’interno 18 U.I. di eparina di litio, eparina di ammonio o di eparina di sodio per 1ml di sangue. Questi additivi sono degli anticoagulanti che inibiscono la cascata coagulativa attivando antitrombine ed inibendo in questo modo la coagulazione del campione ematico. Le provette con EDTA hanno adeso all’interno EDTA K2 o EDTA K3. La provetta è disponibile anche con una soluzione liquida 8% di EDTA. L’EDTA lega gli ioni del calcio inibendo in questo modo la cascata coagulativa. Le provette EDTA VACUETTE® possono essere utilizzate direttamente sugli analizzatori automatici senza che sia necessario aprirne i tappi. Gli eritrociti, i leucociti e i trombociti in un campione di sangue anticoagulato per mezzo di EDTA rimangono stabili fino a 24 ore. Quelle per glucosio sono disponibili con vari additivi, contengono un anticoagulante e uno stabilizzatore: EDTA e fluoruro di sodio / ossalato di potassio e fluoruro di sodio / eparina di sodio e fluoruro di sodio / eparina di litio e litio monoiodoacetato. Le provette per i gruppi sanguigni sono disponibili con la soluzione di ACD (Acid Citrat Dextrose) in due formulazioni (ACD-A or ACD-B) o con la soluzione CPDA (Citrate Phosphate Dextrose Adenin). L’omocisteina viene oggi considerata come uno dei più importanti fattori di rischio cardiovascolare. Un alto tasso di omocisteina aumenta difatti di tre volte il rischio di ictus o infarto cardiaco. Dopo il prelievo di sangue il campione continua a rilasciare omocisteina. Questo processo può alterare i risultati d’analisi dando dei falsi dati. Per questa ragione è importante stabilizzare il campione se non si può centrifugarlo immediatamente. Le provette per VES contengono una soluzione tamponata 3.8% di trisodio citrato (0.129 mol/l). Rapporto diluizione: 1 parte di soluzione di citrato con 4 parti di sangue.