L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa.
Elettroforesi su Gel di Agarosio
L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità. La separazione è di 8-1000 bp.
DNA fino a 1-10 ng di DNA può essere caricato in un gel molto sottile (Sambrook et al., 1989).
L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici. L'agarosio gelifica a basse temperature (rispettivamente 65°C e 35°C).
Fattori che Influenzano la Velocità di Migrazione
Diversi fattori possono influenzare la velocità di migrazione del DNA attraverso il gel di agarosio:
- Peso molecolare
- Concentrazione di agarosio
- Conformazione DNA
- Voltaggio applicato
- Intercalanti
- Tampone di elettroforesi
È importante che i parametri elettrici vengano mantenuti costanti durante la corsa. La differenza di potenziale utilizzata influenza il potere di risoluzione.
La velocità di migrazione (log10) è di circa 5 volts/cm.
Bromuro di Etidio: Visualizzazione del DNA
Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l’etidio bromuro. Questa molecola planare si inserisce ("in situ", intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette luce arancio a 590 nm quando irradiata con luce ultravioletta (300 nm).
L’etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), al campione, o, alternativamente, dopo l’elettroforesi.
È importante prestare attenzione quando si lavora con i raggi UV, poiché possono danneggiare le molecole di DNA. Si raccomanda di utilizzare una luce meno pericolosa per gli occhi.
Considerazioni sulla Migrazione e Visualizzazione
La migrazione del DNA è influenzata dalla taglia e forma delle molecole migranti, le molecole più piccole migrano più velocemente. È essenziale che le molecole si comportino omogeneamente quanto alla migrazione, in modo che ogni area del gel sia distinguibile da un’altra area.
L'uso di bromuro di etidio permette di visualizzare efficacemente il DNA separato.
Elettroforesi su Gel di Acrilammide
L'elettroforesi su gel di acrilammide (PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis) è una tecnica che serve principalmente per analizzare e separare le proteine, sfruttando le dimensioni e la carica delle proteine stesse. Questa tecnica può essere paragonare a quella dei gel di poliacrilamide.
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