Scopri il Potere della Elettroforesi Denaturante con Beta-Mercaptoetanolo per Risultati Imbattibili!

L'elettroforesi è una tecnica che permette di separare, mediante l'applicazione di un opportuno campo elettrico, molecole presenti in soluzione sotto forma di specie elettricamente cariche.

Preparazione del Gel

Lo spessore dei vetri utilizzati per questo esperimento è di 0,75 mm. Nella fase di montaggio bisogna assicurarsi che i vetri siano ben allineati in basso; ciò eviterà, durante la fase di versamento del gel, che il liquido fuoriesca. Tenere ben presente che i vetri si montano tenendo quello con il profilo dentellato con il verso opposto a quello dell'operatore, cioè verso l'interno.

Ricordare che prima si carica il running gel (fino a circa ½ centimetro di distanza dai pozzetti) e poi lo stacking gel.

Running Gel

Si mescolano bene i componenti e si versa il gel appoggiando la pipetta su uno degli angoli dei vetrini cercando di non formare bolle d’aria, fino a circa ½ cm dal livello precedentemente segnato. Mettere poi dell’acqua distillata fino al bordo superiore del vetrino.

Stacking Gel

A polimerizzazione avvenuta del running gel, si asciuga l’acqua soprastante con della carta assorbente e si versa lo stacking gel con le stesse precauzioni viste prima per evitare le bolle d’aria.

Esecuzione dell'Elettroforesi

Dopo la polimerizzazione dello stacking gel, infilare il tutto nelle apposite guide nel supporto portaelettrodi. Versare il running buffer prima nello spazio tra le due coppie di vetri, assicurandosi della perfetta tenuta, e poi all’esterno, nella vasca. Quando si è pronti per seminare i pozzetti, si potrà aggiungere il buffer fino in cima.

Preparazione del Campione

Come campione è stata preparata una soluzione di tre enzimi: fosfatasi acida (200 mg), fosfatasi alcalina (200 mg), invertasi (200 mg) portati a 100 mL con il sample buffer. La soluzione è stata diluita a 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16 (volume finale 500 μL: in ogni provetta sono stati aggiunti 60 μL di β-mercaptoetanolo e circa 10 gocce di blu di bromofenolo allo 0,03 %.

Si macina il materiale da cui estrarre il materiale proteico in un mortaio (circa 2 grammi): se necessario si aggiunge un po’ di tampone Tris-HCl pH 6.8 125mM. Si centrifuga per 3 minuti e si preleva il surnatante. Miscelare 100 μL di surnatante con una uguale quantità in volume di miscela denaturante così composta: Tris-HCl pH 6.8 125mM / 10% 2-mercaptoetanolo / 10% SDS / 10% glicerolo (aggiungere 2 o 3 gocce di blu bromofenolo come colorante tracciante). Nel caso in cui si ha un campione liquido miscelare 100 μL di quest’ultimo con 50-100 μL di miscela denaturante.

Si miscela il campione proteico nella quantità 1:1 con un buffer concentrato 2x, contenente il 2% SDS, 20% di glicerolo, 20 mM Tris-Cl, pH 8, 2 mM EDTA, un agente riducente quale il ditiotreitolo o il 2-mercaptoetanolo, ed una piccola quantità di blu bromofenolo come colorante tracciante.

Semina e Corsa Elettroforetica

Quando si è pronti per la semina, come già detto si aggiunge il running buffer fino in cima, in maniera tale da sommergere completamente i pozzetti. Si seminano solo quelli in buono stato (quelli integri e con i bordi molto netti) con una siringa Hamilton; per ogni pozzetto si utilizzano circa 15 μL (con i vetri spessi 0,75 mm) di campione diluito secondo le istruzioni già descritte.

Nella prova descritta dalle foto è stato utilizzato il Prestained Protein Molecular Weight Marker #SM0441 della MBI Fermentas. Le proteine presenti in questo STD sono 6 ed hanno un peso molecolare medio che va da 20 KDa a 120 KDa.

Si fa correre a V costante (120V) per circa 1 ora. Quando il fronte del colorante è arrivato in fondo, si ferma la corsa. Si stacca prima di tutto la corrente (IMPORTANTE, altrimenti si fa una finaccia) e si aprono delicatamente (molto delicatamente) i vetrini.

Il gel viene posto nello staining (ad esempio il Blu Coomassie) oppure, se si deve procedere con il western blotting, viene prima posto nel tampone di trasferimento (transfer buffer).

Colorazione del Gel

Preparare il colorante secondo queste quantità: 400 mL di metanolo, 100 mL di acido acetico e 500 mL di acqua deionizzata. Sciogliere in questa miscela 2,5 g di Blue Coomassie R-250. Coprire il gel con la soluzione colorante, chiudere in una scatola di plastica e lasciare circa 30 - 40 minuti. Decolorare con la miscela decolorante così formulata: 400 mL di metanolo, 100 mL di acido acetico e 500 mL di acqua deionizzata, sotto agitazione tutta la notte.

Le due bande a sinistra si riferiscono alla miscela di enzimi diluita a 1/2 (quantità approssimativa circa 60 μg); le altre 3 bande si riferiscono alla miscela diluita a 1/4 (circa 30 μg).

Precauzioni

ATTENZIONE: la miscela denaturante è puzzolente e tossica. Usare i guanti e lavorare sotto cappa.

L'acrilammide è un potente neurotossico! Utilizzare i guanti e la mascherina durante la preparazione dei reagenti.