Scopri Come l’Analisi delle Mutazioni del DNA Rivoluziona la Biologia con PCR ed Elettroforesi!

L'analisi delle mutazioni del DNA è un campo cruciale nella biologia molecolare e nella genetica, permettendo di identificare alterazioni nel materiale genetico che possono essere alla base di diverse patologie o variazioni fenotipiche. Due tecniche fondamentali in questo ambito sono la PCR (Polymerase Chain Reaction) e l'elettroforesi.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

La Polymerase chain reaction, PCR, è una metodologia introdotta verso la metà degli anni Ottanta del secolo scorso, che permette l’amplificazione esponenziale di sequenze di DNA attraverso una reazione enzimatica ciclica in vitro che utilizza l’enzima DNA polimerasi (da cui il nome reazione a catena della polimerasi). Per una serie di sue caratteristiche quali la versatilità, la semplicità, la rapidità, l’economicità, la capacità di amplificare anche quantità minime di DNA (in linea di principio anche da una singola molecola) e anche a partire da preparazioni non particolarmente integre o pure, la PCR ha avuto un successo difficilmente sovrastimabile e ha trovato applicazioni in campi disparati.

La PCR è utilizzata per la diagnostica molecolare, le biotecnologie legate alla biologia molecolare, la medicina forense, lo studio molecolare dell’evoluzione, lo studio dell’espressione genica, la dissezione molecolare delle interazioni tra DNA e proteine che regolano la trascrizione e altre ancora. Non sorprendentemente, il giro di affari legato all’utilizzo della PCR viene calcolato in miliardi di dollari e introducendo la parola PCR nel motore di ricerca di PubMed (il sito delle pubblicazioni scientifiche in medicina gestito dagli istituti nazionali della salute degli Stati Uniti) vengono richiamati più di 300.000 articoli. Ciò che è impressionante della PCR è la semplicità del suo principio, cosicché questa tecnica è un vero e proprio ‘uovo di Colombo’.

Il principio della PCR si basa sul fatto che il DNA è composto di due filamenti complementari e che a ogni ciclo di sintesi da parte della DNA polimerasi si raddoppia il numero di copie di sequenza disponibili per il successivo ciclo di reazione. Di conseguenza, in condizioni ottimali, la quantità di DNA prodotto da una reazione di PCR è 2ⁿ volte la quantità iniziale dove n è il numero di cicli. In altre parole, dopo 30 cicli di PCR, che corrispondono in condizioni standard a meno di 2 ore di reazione, si è prodotta una quantità di DNA pari a circa 1 miliardo di volte la quantità iniziale.

Se è vero che nelle sue condizioni più elementari la PCR richiede pochissima tecnologia, al limite solo tre bagnetti termostatati, è pur vero che la PCR è stata motivo di stimolo per innovazioni tecnologiche che vanno dalla produzione e purificazione di DNA polimerasi termostabili (con diverse caratteristiche di processività e fedeltà al disegno), alla produzione di termociclatori sempre più rapidi e precisi.

Introduzione di Mutazioni con PCR

Sono frequenti le circostanze in cui, per determinati approcci sperimentali, può essere importante introdurre mutazioni in un gene e studiare le conseguenze funzionali di questa alterazione. Un esempio tipico è quello rappresentato dal tentativo di modificare la sequenza del DNA in modo tale da ottenere che la proteina da esso codificata abbia un amminoacido al posto di un altro. La PCR offre una maniera rapida ed efficace per una tale mutagenesi. Basterà amplificare la regione di DNA che interessa con due primer, uno dei quali contenga la mutazione desiderata. Naturalmente sarà necessario utilizzare condizioni di anealing che permettono l’appaiamento tra il primer, e il DNA bersaglio nonostante la piccola differenza tra le due sequenze.

DNA Fingerprinting (AP-PCR)

Il DNA fingerprinting (ovvero prendere le impronte digitali del DNA), chiamato anche AP-PCR (Arbitrary primed-PCR), è una tecnica pubblicata nel 1990, contemporaneamente da due gruppi di ricerca − John Welsh e Michael McClelland; John G. K. Williams, Anne R. Kubelik, Kenneth J. Livak, J. Antoni Rafalski e Scott V. Tingey − che permette di mettere in evidenza differenze tra due o più campioni di DNA. Questo metodo non richiede la conoscenza preliminare della sequenza di un bersaglio da amplificare, proprio perché fa uso di uno o più oligonucleotidi di sequenza arbitraria. Il metodo si basa sulla esecuzione di pochi cicli della PCR utilizzando una temperatura di anealing bassa, tipicamente 40 °C, seguiti da una PCR in condizioni standard.

Se il campio-ne iniziale di DNA è sufficientemente complesso, cioè se contiene un gran numero di sequenze diverse, il primer troverà molti siti a cui legarsi durante i primi cicli a temperatura bassa, perché a 40 °C sono sufficienti una decina di basi di complementarità per un anealing efficiente. Alcune di queste sequenze saranno a distanza di qualche centinaio di basi tra loro, su eliche opposte del DNA e in direzione convergente, in altre parole soddisfano alle condizioni per essere amplificabili con efficienza in una PCR. Ne consegue che la Taq polimerasi, nei primi cicli a bassa temperatura, sintetizzerà un certo numero di mo-lecole che corrispondono a quelle porzioni del DNA nel campione di partenza comprese tra due regioni di relativa omologia con il primer arbitrario.

Queste sequenze saranno poi amplificabili durante i cicli successivi, in condizioni standard di PCR, in quanto i frammenti prodotti nei primi cicli sono stati fatti allungando il primer e quindi ora hanno alle estremità una omologia al 100% con esso. È importante tenere presente che, col procedere della reazione di PCR, i diversi prodotti dell’amplificazione competono tra loro in quanto utilizzano gli stessi primer e quindi, tra tutte le sequenze inizialmente prodotte, ne verranno selezionate il sottoinsieme di quelle che si amplificano con maggiore efficienza.

Alla fine i prodotti di reazione vengono separati tra loro con metodi standard che distinguono i frammenti di DNA a seconda della loro lunghezza (generalmente elettroforesi su gel di acrilammide o di agarosio). Il repertorio di bande che si ottiene è caratteristico del campione originale di DNA, perché differenze anche di un solo nucleotide possono distruggere o creare un bersaglio per il legame del primer e inserzioni e delezioni alterano la lunghezza dei prodotti di amplificazione e modificano la loro resa nella reazione. Il DNA fingerprinting, quindi, permette di determinare se e quanto due o più campioni differiscano tra loro.

Real-Time PCR (RT-PCR)

Uno dei principali svantaggi della PCR classica consiste nel fatto che male si presta a un’analisi quantitativa delle sequenze inizialmente presenti nel campione da esaminare. In effetti, la quantità di prodotto ottenuto in una reazione di PCR, dopo una crescita esponenziale, raggiunge un livello di saturazione che dipende essenzialmente dalla quantità dei primer e dei nucleotidi presenti nella reazione e non dal numero di copie di DNA bersaglio presente nel campione. Questi inconvenienti sono stati superati con la messa a punto di una procedura conosciuta con il nome di Real-time PCR (RT-PCR), ovvero PCR in tempo reale, che permette di monitorare ciclo per ciclo la sintesi di DNA durante la reazione di PCR.

La RT-PCR si basa sul fatto che la quantità di prodotto formato viene misurata durante il processo di amplificazione utilizzando una molecola che cambia di fluorescenza proporzionatamente alla quantità di DNA a doppia elica che viene sintetizzato. Vi sono essenzialmente due tipi di indicatori fluorescenti che vengono utilizzati nella RT-PCR: quelli ‘non sequenza specifici’ e quelli ‘sequenza specifici’. I primi sono piccole molecole che cambiano di emissione quando si intercalano al DNA a doppia elica; i secondi sono oligonucleotidi complementari al DNA da amplificare, detti reporter. Questi si legano alle sequenze di DNA sintetizzato, in una regione diversa, da dove si legano i primer di amplificazione e quindi senza competere con questi ultimi.

I principali vantaggi dei reporter rispetto agli intercalanti, sono una maggior specificità e la possibilità di esaminare contemporaneamente, nella stessa reazione, più prodotti di amplificazione diversi utilizzando fluorofori che emettono a lunghezze d’onda differenti. All’inizio di una reazione di RT-PCR lo strumento misura solamente un rumore di fondo, mano a mano che più molecole di DNA sono sintetizzate, la fluorescenza aumenta fino a superare un livello-soglia, dopo di che viene rilevata come un segnale che cresce esponenzialmente per un certo numero di cicli per poi andare in saturazione. Il ciclo di amplificazione in cui il segnale supera il livello-soglia (detto CT dall’inglese Treshold cycle) permette una misura comparativa del numero di copie iniziali di sequenza presenti nel campione.

Elettroforesi

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa.

Elettroforesi su Gel di Agarosio

L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.

Fattori che fanno variare la velocità di migrazione sono:

Peso molecolare
Concentrazione di agarosio
Conformazione DNA
Voltaggio applicato
Intercalanti
Tampone di elettrofore

L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici.

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l’etidio bromuro. Questa molecola planare si inserisce (intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette luce fluorescente quando irradiata con luce ultravioletta (300 nm). L’etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), al campione, o, alternativamente, dopo l’elettroforesi.

Elettroforesi su Gel di Acrilammide

L'elettroforesi su gel di acrilammide (PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis) è una tecnica che serve principalmente per analizzare e separare le proteine, sfruttando le dimensioni e la carica delle proteine stesse.